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通過Morris水迷宮實驗在大鼠體外循環導致的術後認知功能障礙中的作用
點擊次數:572 發布時間:2020-03-23

神經調節素受體降解蛋白(Nrdpl)在老年大鼠體外循環導致的術後認知功能障礙中的作用及機製研究

摘要

目的:通過建立老年大鼠體外循環(cardiopulmonary bypassCPB) 導致的術後認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunctionsPOCD)

模型,初步探討老年大鼠CPBPOCD及海馬神經元凋亡與神經調節 素受體降解蛋白(Nrdpl)的相關性。通過慢病毒構建空載質粒Nrdpl 過表達及沉默海馬神經元細胞,探討Nrdpl在缺氧複氧模型中對神經 元細胞凋亡的調控作用;並通過基因幹擾大鼠海馬Nrdpl的表達,在 載體水平探討Nrdpl對老年大鼠CPBPOCD的影響及其發揮作用的 調控機製是否與Nrdpl泛素化降解底物蛋白ErbB3及下遊AKT信號通 路,促進神經元凋亡有關。

方法:

第1部分

選取18月齡SD (Sprague-DawleySD)雄性大鼠60隻,按照隨 機數字表法分為三組n=20),即對照組C組)、假手術組S組)、 模型組M組)。建模前對老年大鼠進行為期5天的行為學基線測試及 Morris水迷宮訓練。C組做為空白對照組,S組大鼠隻做對應的血管結 紮,而未進行CPBM組為CPB組。通過Morris水迷宮實驗觀察三 組老年大鼠術後第1、3、7天行為學的改變,包括1.定位巡航實驗(測

量逃逸潛伏期和遊泳速度)、2.空間探索實驗(測量停留時間百分比和 停留路程百分比),以評價CPB對學習、記憶功能的影響。造模結束 後,通過使用酶聯免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assayELISA)檢測CSM三組大鼠在CPB後第1、3、7天海馬組織中炎 因子TNF-aIL-lp的含量。用Westem-blot實驗方法檢測CSM三 組大鼠CPB後海馬組織中NrdplErbB3、p-AKTC.Caspase3的表達 水平。通過 TUNEL 染色法(Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labelingTUNEL),分別觀察 CS、M 三組大鼠海馬 CA1、 CA3、DG區的神經元凋亡情況,並計算其凋亡指數。

第二部分

體外培養海馬原代神經元細胞,采用重組克隆技術,在細胞培養 的第5天將慢病毒轉染到培養所得的海馬原代神經元,構建特異性 Nrdpl過表達組、特異性Nrdpl沉默組以及空載質粒組海馬神經元。慢 病毒轉染72小時後構建細胞缺氧複氧模型,將海馬原代神經元按照隨 機數字表法分為5組:空白對照組C組)、缺氧複氧組H/R組)、空 載質粒缺氧複氧組(H/R+NC)、Nrdpl過表達缺氧複氧組(H/R+Nrdpl )、Nrdpl 沉默缺氧複氧組(H/R+shNrdpl )〇Westernblot檢測NrdplErbB3、p-AKTAKTC.Caspase3蛋白的變化情況。采用MTT法檢 測神經元的活性。流式細胞儀檢測神經元的凋亡情況。

第三部分

選取18月齡SD雄性大鼠60隻。15隻大鼠進行預實驗,通過顱 腦定位儀將慢病注射大鼠海馬CA1區,構建空載質粒Nrdpl 過表達及沉默大鼠。剩餘45隻大鼠實施CPB手術,隨機分為5 n=9):空白對照組C組)、體外循環組M組)、空載質粒體外 循環組M+NC組)、Nrdpl過表達體外循環組M+Nrdpl)、Nrdpl 沉默體外循環組M+shNrdpl組)。通過Morris水迷宮實驗觀察五組老 年大鼠術後行為學的改變,包括1.定位巡航實驗、2.空間探索實驗,以 評價CPB對學習、記憶功能的影響。TUNEL熒光染色,觀察各組大 鼠海馬CA1區的海馬神經元凋亡情況Western blot實驗方法檢測五組 大鼠在 CPB 後海馬組織中 NrdplErbB3、p-AKT、AKT C.Caspase3 蛋白的變化情況。

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