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觀察溫腎健脾法對腹瀉型腸易激綜合征大鼠內髒敏感性及曠場實驗的影響
點擊次數:799 發布時間:2019-10-25

溫腎健脾法對腹瀉型腸易激綜合征大鼠內髒敏感性和曠場實驗的影響

【摘要】 目的 觀察溫腎健脾法對腹瀉型腸易激綜合征( IBS) 模型大鼠內髒敏感性及曠場實驗的影響。方法 28 隻乳鼠隨機分為正常組、模型組、溫腎健脾方組、匹維溴銨組 4 組,每組 7 隻。模型組、溫腎健脾方組及匹維溴銨組乳鼠自出生第 2 天 ~ 第 21 天每天與母鼠分離 3 h,正常組不予幹預。第 22 天斷奶,予常規自由飲食。第30 天起模型組、腎健脾方組及匹維溴銨組予以番瀉葉水煎液灌胃,同時溫腎健脾方組和匹維溴銨組分別以溫腎健脾方溶液和匹維溴銨片混懸液灌胃。正常組、模型組以相同劑量生理鹽水灌胃,連續 4 周。觀察各組大鼠腹壁撤退反射評分( AWR 評分) 及曠場試驗結果。結果 溫腎健脾方和匹維溴銨治療可以顯著降低腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠 AWR 評分,緩解其內髒敏感性,顯著緩解大鼠精神萎靡,提高其活躍性。結論 溫腎健脾方可有效改善腹瀉型腸易激綜合征模型大鼠的內髒敏感性及焦慮抑鬱樣行為。

 

腸易激綜合征( Irritable bowel syndrome,IBS) 是臨床上常見的一種功能性腸道疾病,常以腹痛、腹

瀉、便秘等為主要臨床表現[1 - 2]。我國發病率約為1% ~ 16%[3]。腹瀉型腸易激綜合征 ( Diarrhea -predominant irritable bowel syndrome,IBS - D) 是 IBS常見的亞型,占 IBS 23. 3% ~ 65. 0%[4],以反複腹瀉、腹痛發作為主要臨床表現,常伴焦慮、抑鬱等精神心理異常[5]。研究發現,IBS 發病多與胃腸道動力異常以及內髒感覺高敏感性有關[6]。魏瑋教授臨床用溫腎健脾法治療 IBS - D 患者臨床療效甚佳[7],本實驗通過觀察溫腎健脾法對 IBS - D 大鼠內髒敏感性及曠場實驗的影響,探索溫腎健脾法治療 IBS - D 的療效和作用機製,為溫腎健脾法在臨床的推廣應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 實驗動物 28 隻 SD 大鼠乳鼠及 SD 大鼠母鼠購自湖北省實驗動物研究中心。等級: SPF 級,動物批號: 42000600023620,實驗動物使用許可證號:SYXK( 鄂) 2013 - 0069。

1. 1. 2 實驗藥物 番瀉葉,藥物購於中國中醫科學院望京醫院; 溫腎健脾方由肉豆蔻 15 g,補骨脂 30g,五味子 9 g,吳茱萸 9 g,黨參 30 g,白術 15 g,鬱金18 g,生薑 10 g,大棗 10 g 組成 。藥物購於中國中醫科學院望京醫院。匹維溴銨,購於北京萬生藥業有限責任公司,國藥準字 H20133036。

1. 1. 3 試劑與儀器 球囊導管 ; 曠場實驗箱: 上海芭乐app最新版下载黄( XR -XZ301) ; YP402N 電子天平 ; AHB - 2 - LB 照相機 。

1. 2 實驗方法

1. 2. 1 分組與給藥 參照課題組前期造模方法造模 [8]。28 隻剛出生乳鼠隨機分為 4 組,每組 7 隻,並與 1 隻母鼠同籠飼養。模型組( Model 組) 、溫腎健脾方組( WSJP 組) 及匹維溴銨組( Pinaverium bromide 組) 乳鼠於出生後第 2 天 ~ 第 21 天每天上午9: 00 - 12: 00 與母鼠分離 3 h,正常組( Normal 組) 不予幹預。第 22 天斷奶,予常規自由飲食。第 30 天起模型組、溫腎健脾方組及匹維溴銨組以 1. 0 g /ml番瀉葉水煎液灌胃( 10 ml / kg) ,1 次/ d。同時溫腎健脾 方 組 將 中 藥 定 量 加 水 400 ml,煎 煮 濃 縮 至200 ml,按 10 ml / kg 灌胃給藥,2 次/ d( 大鼠用藥劑量= 人體用藥劑量 × KB/KA,KB = 0. 71,KA = 0. 11) 。匹維 溴 銨 片 碾 碎 後 溶 於 蒸 餾 水 配 製 成 濃 度 為1. 5 mg /ml混懸液,按15 mg /( kg·d) 劑量灌胃給藥,2 次/ d( 即匹維溴銨組灌胃劑量為30 mg/( kg·d) 。正常組、模型組以相同體積生理鹽水灌胃,連續 4 周。

1. 2. 2 觀察指標

1. 2. 2. 1 一般情況 觀察大鼠的精神狀態、體質量、活動情況、毛發光澤度、食欲、大便性狀等。

1. 2. 2. 2 腹壁撤退反射 造模後大鼠在實驗前24 h禁食不禁水,輕觸其肛門部位使其排盡大便。

在大鼠輕度麻醉狀態下從肛門緩慢插入未充氣且塗石蠟油的後帶球囊的導管,球囊末端距肛門約1 cm,在肛門外1 cm 處將其固定在大鼠尾根部。每隻大鼠給予球囊擴張 3 次,容量分別為 1. 0、1. 5、2. 0 ml,每次擴張持續 30 s。每次 4 min,每隻重複 3 次,每組 7 隻大鼠 AWR 評分( 表 1) 取平均值進行統計分析。

 

1. 2. 2. 3 曠場實驗 曠場實驗( 上海芭乐app最新版下载黄 XR -XZ301) 所用實驗箱為高 30 ~ 40 cm,底邊長為 100

cm 的曠場,周壁的顏色為黑色,曠場底麵被平均分為 25 個 4 cm × 4 cm 的小方格。正上方架攝像頭,

視野覆蓋整個曠場。將大鼠放置在正中央格,同時進行攝像和計時,時間為 5 min。通過計算機示蹤分

析係統來分析大鼠在一定時間內的活動狀態。實驗室要保持安靜,室溫為 20 ℃ 左右,光線充足。觀

察指標: 方格間穿行次數( 動物的四肢從一個格進入另一個格為穿行一次) 、直立次數( 動物雙前肢同

時離地,或者雙前肢放在牆壁尚算作直立一次) 、中央格停留時間、穿越中央格的次數。

1. 3 統計學方法

采用 SPSS16. 0 統計軟件進行數據分析,所有數據以均值 ± 標準差( x ± s) 表示,不同組間兩兩比較

采用單因素方差分析( One - way ANOVA) 中 LSD 法( 小顯著性法) ,P < 0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組大鼠一般狀態觀察

正常組: 大鼠精神狀態良好,活動性積極,糞便呈顆粒狀。毛發色白、光澤度良好。進食及飲水量

正常。模型組: 大鼠精神狀態萎靡,活動積極性明顯減弱,出現困乏狀態。糞便稀薄不成形。毛發色

澤略微發黃,缺少光澤度。飲水量增加而進食量減少。溫腎健脾方組: 大鼠精神狀態有一定程度的恢

複,活動積極性提高。糞便在治療 1 周結束後由稀薄不成形轉為半幹型及顆粒狀。毛發光澤度和進

食量有所提高。匹維溴銨組: 大鼠精神狀態有一定程度的恢複,困乏現象基本消失,活動積極性提高。

糞便在治療 5 天後逐漸轉為半幹型及顆粒狀。毛發光澤度和進食量有所提高。

2. 2 大鼠體質量變化監測

隨著時間延長,各組大鼠體質量都有一定程度的增加。在同一時間點,模型組相較於正常組的體

質量顯著降低; 匹維溴銨組和溫腎健脾方組與模型組比較,大鼠體質量顯著增加; 匹維溴銨組與溫腎健脾

方組體質量比較差異無統計學意義。結果見圖 1。

圖 1 各組大鼠體質量變化

2. 2 腹壁撤退反射( AWR 評分)

在擴張體積為 1. 0 ml 時,與正常組比較,模型組 AWR 評分顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較,

匹維溴銨組 AWR 評分顯著降低( P < 0. 01) ; 與模型組比較,溫腎健脾方組 AWR 評分有所降低,但差異無統計學意義。在擴張體積為 1. 5 ml 和 2. 0 ml 時,與正常組比較,模型組 AWR 評分顯著升高( P <0. 01) ,與模型組比較,匹維溴銨組和溫腎健脾方組AWR 評分顯著降低( P < 0. 01) 。結果見圖 2。

2. 3 曠場實驗

與正常組比較,模型組大鼠直立次數、方格間穿行次數、穿越中央格次數、中央格停留時間均顯著降低( P < 0. 01) 。與模型組相比,溫腎健脾方組與匹維溴銨組直立次數、方格間穿行次數、穿越中央格次數、中央格停留時間顯著升高( P < 0. 01) 。匹維溴銨組與溫腎健脾方組直立次數、方格間穿行次數、穿越中央格次數、中央格停留時間比較差異無統計學意義。結果見表 2 和圖 3。

3 討 論

IBS - D 的病因複雜,發病機製尚未完全闡明,大量的研究表明早期不良生活事件和精神疾病與IBS 的發病關係密切[9 - 10]。本研究造模方法以團隊前期研究的造模方法為基礎,予番瀉葉灌胃聯合母嬰分離,即采用物理化學刺激共同作用的方法製備內髒高敏並脾腎陽虛型 IBS - D 大鼠模型[8,11 - 12]。魏瑋教授的溫腎健脾方是在四神丸基礎上加入黨參、白術、鬱金組成,功效為溫補脾腎、澀腸止瀉。前期研究顯示,該方可有效改善 IBS - D 大鼠腹瀉、倦怠蜷臥、飲食減少、體重下降等一般狀況[13],提示其可用於脾腎陽虛型 IBS - D 大鼠模型的藥物反證。目前評價內髒高敏模型是否成功的方法主要有腹外斜肌放電和腹壁撤退反射評分。因腹外斜肌放電實驗屬於有創性操作,增加實驗複雜度,因此腹壁撤退反射評分在動物實驗中的應用更為廣泛。腹壁撤退反射評分,是通過觀察受刺激後大鼠的腹肌收縮強度給出評分。本研究采用腹壁撤退反射評分,結果顯示模型組較正常組 AWR 評分顯著升高,說明模型組大鼠存在內髒高敏感。而溫腎健脾方和匹維溴銨治療可以顯著降低 AWR 評分,能夠緩解 IBS - D 大鼠的內髒敏感性。

曠場實驗( OFT) 又稱敞箱實驗,是評價實驗動物在新異環境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。在大鼠進入新環境後,會經曆緊張、興奮、探索、適應等心理過程,其活動表現為趨避性,好奇性及探索性的特點[14],因而 OFT 能夠反映大鼠進入空曠區域時的自我情緒,是評價齧齒類實驗動物運動功能和焦慮狀態的經典方法。本研究顯示,模型組大鼠與正常組相比,直立次數、方格間穿行次數、穿越中央格次數、中央格停留時間均顯著降低,說明模型大鼠對新鮮事物的好奇程度降低,精神萎靡,活躍性降低,符合焦慮抑鬱樣行為。與模型組相比,溫腎健脾方組與匹維溴銨組直立次數、方格間穿行次數、穿越中央格次數、中央格停留時間顯著升高。匹維溴銨組與溫腎健脾方組直立次數、方格間穿行次數、穿越中央格次數、中央格停留時間比較差異無統計學意義,說明溫腎健脾方和匹維溴銨具有一定的抗焦慮的作用。

IBS - D 屬中醫“腹痛”“泄瀉”“鬱證”等範疇,其發病與感受外邪、飲食不節、情誌失調及髒腑虛弱等有關。魏瑋教授認為 IBS - D 病位在腸,主要涉及脾、腎、心、肝等,脾腎陽虛是其主要病機,治療應以溫腎健脾為主,創立了四神丸加減化裁而成的溫腎健脾方( 肉豆蔻、補骨脂、五味子、吳茱萸、黨參、白術、鬱金、生薑、大棗等) ,方中補骨脂辛苦性熱而補命門,為壯火益土之要藥; 肉豆蔻溫補脾腎而澀腸止瀉; 吳茱萸暖脾胃而散寒除濕; 五味子性溫而不熱不燥,溫腎固澀; 黨參甘溫補中,補氣升陽,長於止瀉; 白術甘溫性緩、陽中之陰,可升可降,長於補脾益氣、燥濕利水; 鬱金入心治血、體清氣竄,其先上行而微下達,長於行氣解鬱、祛瘀止痛。生薑散寒行水、大棗滋養脾胃,共為佐藥。諸藥相合,則溫腎暖脾,清心解鬱,複運化而固大腸。臨床應用收效明顯,團隊前期開展的研究證實溫腎健脾方在免疫、炎症調控[15 - 16]等方麵均有一定作用。本研究通過腹壁撤退反射、曠場實驗進一步證實溫腎健脾方可有效改善腸易激綜合征模型大鼠的內髒敏感性及焦慮抑鬱樣行為,有關具體作用機製仍需要作進一步的探索。

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