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Morris水迷宮實驗對慢性疲勞模型大鼠認知及海馬神經顆粒素表達的影響
點擊次數:870 發布時間:2019-09-23

龜鹿益神顆粒對慢性疲勞模型大鼠認知行為及大鼠皮質和海馬神經顆粒素表達的影響

 

摘要:目的觀測慢性疲勞CFS)模型大鼠認知的行為水平變化,探索龜鹿益神顆粒對慢性疲勞綜合征發揮幹預作用的 機製。方法雄性SD大鼠60隻,隨機分為空白組,模型對照組,蓯蓉益腎顆粒對照組、龜鹿益神顆粒低劑量組、龜鹿益神 顆粒中劑量組、龜鹿益神顆粒高劑量組,共6組,每組各10隻。除空白組外,其它各組用力竭遊泳、慢性束縛雙重複合應 激構建慢性疲勞大鼠模型,前後造模14 d,隨後,空白組,模型組每天給予生理鹽水灌服,其它各組給予相應藥物灌服,應 用Morris水迷宮實驗評價大鼠其認知行為水平,末次灌胃24 h後解剖大鼠並取材,取大鼠前腦皮質及海馬等組織,采用 蛋白印跡(Westem blotting, WB)試驗方法分別測定大鼠皮質及海馬中神經顆粒素Ng)蛋白表達結果。結果造模成功 及給藥後Morris水迷宮實驗:與模型組相比,重複測量第4天起,龜鹿益神顆粒中、高劑量組及蓯蓉益腎顆粒對照組的逃 避潛伏期明顯減低P<〇. 01);穿越平台次數明顯升高P<〇.〇5)。神經顆粒素蛋白表達水平:和模型組相比較,蓯蓉益 腎對照組、龜鹿益神低、中、高劑量各組Ng表達水平明顯升高(P <0.05);和蓯蓉益腎顆粒對照組比較,龜鹿益神顆粒中、 高劑量組的Ng表達水平明顯升高(P <0. 05)。結論龜鹿益神顆粒能夠明顯改善慢性疲勞模型大鼠認知行為水平,並提 高神經係統中,Ng蛋白的表達,其二者間的關係可能是該藥對慢性疲勞綜合征發揮治療作用的機製之一。

關鍵詞:慢性疲勞綜合征;龜鹿益神顆粒;神經顆粒素 DOI 標識:

美國疾病控製中心CDC)於1988年命名了慢性疲勞綜合征 (Chronic Fatigue Syndrome, CFS),其突出症狀是持續不能改善的 疲憊感,並以低熱、頭痛、咽痛、肌痛、記憶力衰退、注意力難以集 中、抑鬱和睡眠功能障礙為其非特異性表現1。並且CDC在 1994年重修慢性疲勞綜合征診斷標準的時,將認知功能障礙作 出詳細定義,主要為注意力集中困難和短期記憶障礙2]CFS其 臨床特征符合中醫學中“虛勞’ “虛損’“髒躁’“健忘”等範疇,其 中芭乐app最新版本下载官网在長期臨床工作中觀察到,以持續疲勞伴有記憶力減退等 認知功能障礙的CFS患者多見以腎精虧虛為本病的主證,患者 常可見到精神萎頓,眼神渙散、反應遲鈍、四肢無力、記憶力減退, 同時或見腰膝酸軟或冷痛,四肢不溫,xing欲淡漠、頭昏目眩、舌淡 少苔,脈沉弱等腎精虧虛證候的表現,在治療中以‘‘補腎填精、充 養髓海”為原則,常應用龜鹿益神顆粒加減施治,取得較滿意療 效。遂本研究通過“慢性束縛+力竭遊泳”的複合應激造模方 法,進行大鼠模型構建,並應用Morris水迷宮測定逃避潛伏期及 撤除站台後穿越原站台所在區域的頻數來評價研究對象的認知 功能變化水平,並觀察龜鹿益神顆粒對慢性疲勞大鼠認知水準的

改善及皮質和海馬中神經顆粒素(Ng)的定量表達水平的改善, 以期對該方藥幹預治療CFS的機製及效用作出初步探索。

1材料儀器與方法

1.1動物及分組SPF級雄性SD大鼠60體重240 ± 20) g隨機分為6組:空白組正常組模型對照組蓯蓉益腎對照組, 龜鹿益神低劑量組,龜鹿益神中劑量組,龜鹿益神高劑量組,每組 10隻。

1.2藥物龜鹿益神顆粒方藥組成及規格如下:人參顆粒2. 5g x1袋;枸杞顆粒4gx1袋;醋龜板顆粒0.5gx1袋;鹿角霜顆粒 0.5gx1袋;仙鶴草顆粒1gx1袋;仙鶴草約相當於飲片15g,餘 各顆粒均等效於飲片約10g,來源自江陰天江藥業所產中藥小包 裝顆粒劑。蓯蓉益腎顆粒:內蒙古蘭太藥業有限責任公司生產, 產品批號:16091601,國藥準字Z20030099,規格每袋裝2g水合 氯醛。

1.3試劑和儀器試劑:RIPA裂解液:北京索來寶公司,貨號 R0020;—抗:Neurogranin,北京博奧森貨號 bs - 1143R;內參:|3 -actm單克隆抗體,購自中杉金橋公司,貨號TA -09;二抗:辣根 標記山羊抗兔IgG抗體,購自中杉金橋公司,貨號ZB2301; ECL 發光試劑盒:中杉金橋公司,貨號sc - 2048; PVDF膜:Millipore公 司,貨號IPVH00010;X射線膠片:Carestream公司,型號XBT

儀器:稱量天平:Sartorius公司BP310P型;低溫高速離心 機:Eppendorf 公司centrifuge5417R 型;超低溫冰箱:SANYO 公 司MDF - U72V型;超純水儀:北京康銘泰克科技發展有限公司, 蛋白濃度定量儀:Eppendorf公司22331 hamburg型;電泳儀:北 京六一公司,DYCZ -24DN型;半幹轉膜儀係統:ATTO公司, WSE -4040型;轉移脫色搖床:海門其林貝爾儀器,TS -8型;移 液器:Eppendorf公司;分析儀器:Tanon公司,Ta600型。Mor- ris水迷宮係統:上海芭乐app在线观看信息科技公司;XR - XM101型。

1.4造模及給藥方法采取冷水力竭遊泳、慢性束縛的方法製備 CSF模型。慢性束縛:將大鼠置於自製束縛筒(選用圓柱形塑製 瓶18 cm,內徑約6cm,前緣為漏鬥樣通氣口內徑為1.5 cm束縛筒尾端為活動封蓋大鼠束縛過程可正常呼吸使其活動 受限。慢性束縛起始時間30min/d,3天加量15min,逐漸加量 至90min,以免大鼠逐漸順應3。力竭遊泳:自製80 cm X 65 cm x55 cm泳箱泳箱四壁光滑水深約45 cm,超過大鼠身長(包括 鼠尾水溫20 ±2大鼠頭部沒入水下10 s不能回到水麵或泳 姿無力失調作為其力竭評判標準,每天進行14。造模共14 天,正常組不造模,餘5組均給予慢性束縛加力竭遊泳。造模過 程中,龜鹿益神顆粒低劑量組2隻死亡脫落,正常組及龜鹿益神 顆粒中、高劑量組各1隻死亡脫落,予以剔除。

模型製備後,給藥階段,正常組和模型組予以生理鹽水灌胃, 10 mlK kg d),蓯蓉益腎對照組給予相應藥物顆粒混懸液灌 胃,417 mgK kg d);龜鹿益神低、中、高劑量組依次按照1.625 g/ ( kg d). 25 g/ ( kg d)6. 5 g/ ( kg d)製備龜鹿益神顆 粒混懸液,並灌胃1/ d,連續14 d實驗結束後,停藥進食12 h後取材,每隻大鼠按3 ml/ kg給予10%水合氯醛腹腔注射,麻 醉後,斷頭切取前腦皮質及海馬,分別置入凍存管中,放進-20T冰櫃中備用。

1.5觀察指標

1.5.1認知行為指標Morris水迷宮實驗:實驗設備為內徑約 160cm正圓蓄水池內壁塗黑30 cm水深水溫(20 ±2) T,將 水域十字均分為均等麵積的四個象限,隨機選取任一象限設置一 站台,直徑約12cm,站台隱於水麵下1cm,水池正中央上方固定 攝像頭采集圖像,應用Ethovision軟件進行後期圖像處理。水迷 宮設備周遭參照物及光照環境實驗期間前後一致。定位航行實 582 驗:給藥後5 d執行,從四個象限按隨機象限次序將大鼠麵朝 池壁置入水中,記錄其在120 s內找到隱沒於水下的站台並駐留 3 s以上所需的時長,即為逃避潛伏期時間。若120 s後大鼠仍未 尋找到站台,則將其誘導到站台上,且逗留15 s以上以學習記 憶,並將逃避潛伏期記錄為120 s,取來自不同象限的逃避潛伏期 的數學平均數作每日測量數據,連續測量5 d空間探索實驗:給 藥完成後即定位巡航實驗結束的第二曰進行,撤去原有站台,大 鼠隨機象限入水,記錄120s內其軀體穿越原站立台所在區域的 頻次。

1.5.2蛋白印跡(Westem blotting, WB)試驗方法實驗前大鼠斷 食水12 h,給予每隻大鼠100 g/ L的水合氯醛腹腔注射以麻醉,3 mL/ kg,快速取出其前腦皮質及海馬組織在生理鹽水中滌去血 液,用濾紙拭幹後,置於-80T的冰箱中待用。各組分別隨機取 6隻大鼠的前腦皮層組織和海馬組織各50 mg,剪碎後於液氮研 磨至細粉末狀,加入RIPA裂解液混勻,4低溫存儲箱內過夜裂 解。4T12000rpm離心10分鍾,取上清。Eppendorf微量定樣 儀測定蛋白濃度。上樣SDS - PAGE電泳,PVDF膜轉移,5%的 脫脂奶粉密閉2h加入Neurogranin -4T過夜。1 X PBST洗 滌3每次10min,將二抗用1 X PBST稀釋3000倍;洗滌一抗 反應膜後,將其放入二抗工作液中,孵育1.5h洗膜,ECL顯影 將膠片掃描後,P - actin作內參校正,用TanonGis軟件檢測條帶 灰度值。以同一膜上Ng灰度值與內參p -actin灰度值的比值來 反應蛋白表達水平。

1.5.3統計學方法所有數據均采用SPSS21.0軟件進行處理, GraphPad Prism5. 0Demo軟件作圖,計量資料以均數±標準差(X ± s)表示,水迷宮實驗中的逃避潛伏期應用重複測量的多因素方 差分析進行分析:球形檢驗判斷重複測量數據在各個時間點上的 關係是否滿足Huynh Feldt條件,對不滿足Huynh Feldt條件(P < 0. 05),則采用Greenhouse - Geisser法校正自由度,並應用多因素 方差分析每個時間點上的組間差異。餘檢測指標均應用單因素 方差分析進行統計處理,組間顯著性差異水平為P <0.05

2結果

  • _般情況造模前,各組大鼠食量飲水量活動狀況鼠毛 色澤、鼠糞性狀等差異均無顯著意義。製模完成後,造模大鼠食 量、飲水量、活動水平減少,鼠毛的色澤暗淡無光,便溏尾髒等;空 白組一般情況基本同造模前。給藥後,蓯蓉益腎對照組、龜鹿益 神低、中、高劑量各幹預組大鼠進食及飲水量和活動狀況改善均 有不同程度的增加,毛色由暗淡逐漸變為有光澤,溏便情況逐漸 轉好至正常。
  • Morris水迷宮實驗

2.2.1定位航行實驗小鼠逃避潛伏期數據Mauchly球形檢驗 統計量:W = 0. 617P = 0. 006 < 0. 01,不滿足球形假設采用 Greenhouse - Geisser法對自由度進行修正,結果顯示時間因素 (day)有統計學意義F=30.449, P<0.01),各組小鼠逃避潛伏 期隨時間變化而變化的趨勢;時間和分組的交互作用day* group)有統計學意義(F = 1.72, P <0.05),說明時間因素的作用 隨分組的不同而不同。見圖1。每個時間點上兩組之間兩兩比較 提示4天起,和模型組比較,正常組、蓯蓉益腎對照組、龜鹿益 神顆粒中劑量組龜鹿益神顆粒高劑量組的逃避潛伏期明顯降低 (P<0. 01);第4和蓯蓉益腎對照組相比龜鹿益神中高劑 量組的逃避潛伏期明顯降低(P <0. 05),第5天,和對照組相比, 龜鹿益神中高顆粒組逃避潛伏期差異無顯著性意義(P > 0.05)。見圖1及表1

2.2.2空間探索實驗結果顯示,和模型組相比,空白組、蓯蓉益 腎對照組、龜鹿益神顆粒低、中、高各組穿越平台次數明顯增加

 

神經顆粒素Ng)是一種由78個氨基酸組成的、具有鈣離子 敏感性的鈣調蛋白CAM)結合蛋白,也是蛋白激酶C(PKC)的突 觸後底物[11]。主要在於人類及哺乳動物的皮質、海馬、扣帶回等 組織的神經元中的樹突棘高度表達,目前主要學術觀點認為Ng 通過參與神經元突觸的可塑性調節,從而參與學習記憶等智 能活動的調節。主要通過以下幾個方麵:首先NgPKC的化學 底物,經過蛋白質磷酸化後發揮調控突觸後神經遞質受體的活 性,活化後的遞質受體又可反調節以促進Ng的磷酸化,相互增 強,進而使突觸傳遞的效能得到提高;第二,Ng可能是參與學習 記憶活動的主要蛋白激酶的下遊靶點,通過自身的磷酸化作用, 參與到蛋白信號傳導通路的調節,利於神經信號的傳導;再者,長
時程增強LTP)是海馬區域持續加強的突觸聯係的一種生理活 動,國外大量研究證明Ng是參與LTP產生和維持的重要物質基 礎,可能與改變Ca2+CaM複合物濃度及相關蛋白酶活性相 關12。總之Ng通過參與神經遞質、蛋白信號通路及長時程增強 的調節等諸多途徑,達到調節神經突觸結構和功能上的可塑性, 從而發揮對學習記憶等智能水平的影響。

本研究證明,多重應激因素複合製備慢性疲勞模型大鼠後, 其學習記憶能力明顯減退,同時海馬和前腦皮質中神經顆粒素的 蛋白表達含量顯著降低(P <0.01),顯示出疲勞應激所造成的認 知活動障礙與Ng表達減少具有高度相關性。應用龜鹿益神顆 粒實驗幹預及蓯蓉益腎顆粒對照幹預後,皮質及海馬的Ng蛋白 表達水平明顯升高,大鼠的學習記憶等智能活動能力顯著提 高,表現出水迷宮實驗中逃避潛伏期的降低和撤去平台後原平台 停留次數的增多。同時,在與蓯蓉益腎對照組的比較中,在改善 學習記憶能力和Ng蛋白表達水平上,龜鹿益神中、高劑量組明 顯優於對照組即蓯蓉益腎組(P <0.01)

蓯蓉益腎顆粒由肉蓯蓉、巴戟天、五味子、菟絲子、車前子等 組成,具有填精益髓、補養腎氣的作用,可用於腎氣不足所致的腰 膝酸軟、記憶減退、四肢無力等症狀。現代藥理研究證明,蓯蓉益 腎顆粒具有顯著的抗氣化抗疲勞的作用,可明顯改善腎虛模型大 鼠的遊泳時間及自主活動水平;對戊ba比妥na製備的記憶力障礙 大鼠起顯著的改善智力的作用;並可提高環磷酰胺所致的免疫力 低下小鼠的免疫功能水平。國內學者沈小衍等[13]對符合腎氣虛 辨證分型的30名CFS患者進行前後對照臨床觀察臨床總有效 率可達86.7%。選取蓯蓉益腎顆粒作為本研究的對照藥物,符 合試驗的設計要求。

龜鹿益神顆粒是為龜鹿二仙丹加味組成。龜鹿二仙丹出自 《醫便》卷一,其主要組成為龜板膠、鹿角膠、人參、枸杞,以龜板 膠滋陰潛陽,強腎壯骨,鹿角膠養精育血,溫補肝腎,二藥合而為 君以充精填髓,補虛養精,人參益氣健脾養血,枸杞滋補肝腎,在 原方之上加用仙鶴草扶正補虛,治勞力脫損。共奏充養腎精,益 氣血,補虛勞之功效。明代醫家形容其組方:“1陰一陽,無偏攻 之憂,入氣入血,有和平之美……精生而氣旺,氣旺而神昌” [14。 本課題前期研究通過隨機對照實驗證實,龜鹿益神顆粒可明顯增 加CFS模型大鼠的力竭遊泳時間、曠場實驗中的直立及跨格活 動次數,從而使疲勞大鼠的體力疲勞狀態得到較明顯好轉,並能 明顯增加骨骼肌中過氣化物酶激活受體Y輔激活因子1a (PCG -1a)的含量和血清中IL - 2阿片肽等含量從神經-內分泌- 免疫網絡和細胞內線粒體的再生等方麵發揮調控效用,從而治療 慢性疲勞[1516。本實驗研究進一步證明龜鹿益神顆粒可明顯改

CFS大鼠的腦力疲損狀況,提高學習記憶等智能活動水 平。其機製可能與其改善作為智能活動的物質基礎之一的 神經顆粒素的表達狀況,來參與神經突觸可塑性的調劑,其詳細 機製還有待更進_步的研究揭示另其與中醫‘‘腎精”的充養之 間的關係有望得到進一步的探索和認識。

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