產品列表PRODUCTS LIST

首頁 > 技術與支持 > 通過曠場實驗、Morris水迷宮實驗觀察大鼠的情感行為和學習記憶
通過曠場實驗、Morris水迷宮實驗觀察大鼠的情感行為和學習記憶
點擊次數:2714 發布時間:2019-09-17

龜鹿二仙膠對創傷後應激障礙模型大鼠行為學 及海馬GR、5-HT受體表達的影響

目的:觀察龜鹿二仙膠對創傷後應激障礙(posttraumatic stress disorder, PTSD)模型大鼠行為學,海馬糖皮質激素受 體(glucocorticoid receptors, GR) 5-羥色胺5-iydroxytryptamine, 5-HT)受體 1A 亞型5-HT1A)2A 亞型5-HT2A)表達的 影響。方法:采用單一延chang刺激方法製作大鼠PTSD模型,通過曠場實驗、拒俘反應實驗以及Morris水迷宮實驗觀察大鼠 的情感行為和學習記憶能力的改變。采用RTTCR法檢測海馬GR5-iT1A5-HT2A受體表達。結果:PTSD大鼠表現 出多種情感行為障礙,學習能力顯著降低(P <0.01)。海馬GR表達增強(P <0.01),5-HT1A受體表達下降(P <0.05), 5-HT2A受體表達則升高(P <0. 05)。龜鹿二仙膠(2.025 g ?kg ?1)和ying羊藿總黃酮0. 06 g ?kg?1)能顯著改善PTSD大 鼠的情感行為障礙,提高學習記憶能力P<0. 05P<0. 01)。龜鹿二仙膠2.025 g ?kg?1)和ying羊藿總黃酮0.06 g ?kg1)可以明顯降低PTSD大鼠海馬GR的表達水平,升高5-HT1A受體表達水平和降低5-HT2A受體表達水平(P < 0.05P<0.01)。結論:龜鹿二仙膠對PTSD具有良好的幹預治療作用,其作用機理與改善情感行為和認知功能以及調 節海馬GR5-HT1A5-HT2A受體表達有關。

 

近年來創傷後應激障礙post~traumatic stress disorder, PTSD)的患病率呈逐年上升趨勢mPTSD 屬於精神心理綜合征的範疇,是個體經曆超常的威 脅性災難性的創傷事件後呈現典型常見的 身心障礙0PTSD不僅給個人、家庭帶來極大負 擔,還進一步影響著社會的穩定和諧。中醫藥以其 獨特的理論和治法方藥在防治PTSD研究方麵,顯 示出良好的應用前景。本課題組以‘‘腎藏精,在誌 應恐”的中醫理論為指導,運用龜鹿二仙膠開展防 治PTSD的相關研究。初步的研究結果表明,龜鹿 二仙膠對條件性恐懼記憶的形成具有抑製作用H。 本實驗通過建立PTSD大鼠模型,觀察大鼠行為學、 海馬糖皮質激素受體(glucocorticoid receptor, GR)5-羥色胺(5~hydroxytryptamine, 5~HT)受體 1A 亞型 (5~HT1A)、A亞型(5~HT2A)表達的影響,進一步 明確龜鹿二仙膠防治PTSD的效應及其部分機理。

1材料與方法

1.1實驗藥物龜鹿二仙膠:產品購自河南省新四 方製藥有限公司,國藥準字Z41022262,批號: 090105,規格:每瓶200 g。ying羊藿總黃酮:產品購自 陝西省西安市天園生物製劑廠,批號:TY20090620, 規格:每瓶200 g。ying羊藿總黃酮用蒸餾水配製為 30 g • L-1的溶液每次配製250 mL,置於4 °C冰箱 內保存備用。鹽酸氟西汀膠囊:產品購自美國禮來 蘇州製藥有限公司,規格:每粒20 mg,批號: 204362,用生理鹽水將膠囊內粉末配製成0. 18 g • L-1混懸液,4 C冰箱內保存備用。

1.2 實驗動物 SPF Sprague-Dawley (SD)雄性 大鼠,體質量(180 ±20) g,購於廣州中醫藥大學實 驗動物中心(實驗動物質量合格證號分別為: 0061199,0065089,0067723),自由飲食在光暗周期 為12 h,溫度為(23 ±2) °C通風良好的實驗室條件 532

適應性喂養7 d每天輕撫大鼠5 min,使其逐漸適 應實驗者的操作。

1.3實驗試劑Trizol提取總RNA試劑盒(美國 Invitrogen公司,逆轉錄■聚合酶鏈式反應試劑盒、 TaqDNA 聚合酶dNTPAccess QuickRT-PCR sys-tem (美國 Promega 公司SYBR Green 熒光染料 (美 國 Gibco 公司SYBR Green PCR Master Mix (美國 MJ公司PCR引物合成(上海生工生物工程技術 服務有限公司

1.4實驗儀器XR-XZ301大鼠曠場實驗分析係 統上海芭乐app在线安装信息科技有限公司水迷宮Smart視 頻追蹤係統San Diego Instrument,美國LE-CEND MICRO 21R台式高速冷凍離心機Th ermo 公司,美 國Prism 7000 型 Real-time Quantitative PCR system (MJ公司美國

1.5實驗方法實驗動物按體質量隨機分為7組, 即對照組,模型組,龜鹿二仙膠高劑量組、低劑量組, ying羊藿總黃酮高劑量組、低劑量組,鹽酸氟西汀組。 對照組不應激、不給藥,灌服等量生理鹽水;模型組 給予單_延chang刺激,不給藥,灌服等量生理鹽水。龜 鹿二仙膠高劑量組、低劑量組第1天造模,第2天開 始每天分別給予龜鹿二仙膠1. 012 5 g • kg-12.025 g • kg-1灌胃,連續14 d。ying羊藿總黃酮高劑 量組、低劑量組第1天造模,第2天開始每天分別給 予ying羊藿總黃酮0. 03 g • kg-10. 06 g • kg-1灌 胃連續14 d鹽酸氟西汀組第1天造模第2天開 始每天給予鹽酸氟西汀1.8 mg • kg-1灌胃,連續 14 d各組大鼠第16天進行曠場實驗、拒俘反應實 驗Morris水迷宮實驗等。

1.5.1 PTSD模型製作采用公認的單一延

chang刺激(single-prolonged stress, SPS)造模方法由 2005年日本文部省召開的“基礎和臨床研究進展” 會議確定4 ,單_延chang刺激處理步驟如下:將

大鼠禁錮2 h後,立即強迫遊泳20 min (水溫25 °C , 水深40 cm),休息15 min,yi醚麻醉至意識喪失, 不再給予任何刺激,在籠中自然蘇醒,常規飼養直至 取材。禁錮過程中采用的材料為錐體形的硬質塑料 筒,其長度和直徑可根據大鼠體形的特點進行調節。 大鼠尾部始終暴露在禁錮材料外,其軀幹及四肢不 受壓迫,但無法自由活動。

1.5.2曠場實驗實驗裝置包括曠場反應箱和數 據自動采集和處理係統兩部分,大鼠曠場反應箱內 全塗黑箱高40 cm,底邊長100 cm,底麵平均分設 25個小方格(4 cm X 4 cm),正上方2 m處固定數碼 攝像頭,視野範圍覆蓋曠場內部。曠場白天光照由 兩側牆壁的4隻節能燈發出約200 lux照度來模擬, 夜晚照明由一側牆的紅外光源提供。室內隔音。觀 察5 min內大鼠的行為表現,指標包括水平活動距 離,直立、呆滯、修飾行為次數,排便顆粒數。每次實 驗均在上午7 : 00 -12 : 00進行,兩次實驗之間將 箱底打掃幹淨。

1.5.3拒俘反應實驗用手套(大鼠從未接觸過) 輕抓大鼠,觀察並記錄其反應。具體記分標準如下: 0分,很容易抓取;1分,尖叫或回避;2分尖叫並回 避;3分,逃脫;4分逃脫並尖叫;5分試圖撕咬手 套;6分,主動躍起攻擊。根據評分來評價大鼠恐懼 與衝突素質特征改變5

  • Morris水迷宮實驗各組大鼠第16天進 行Morris水迷宮實驗水溫設定為25 C,實驗方法 參照文獻6]進行。首先進行大鼠尋找水中平台 (高出水麵1 cm)的訓練,每隻大鼠先置於平台上適 應25 s,然後從NSEW4個不同象限的入水點將 其投入水中,若超過60 s大鼠仍未抵平台,由實驗 者引導其回到平台上停留15 s,如此重複3次擦幹 大鼠放回飼養籠。同天進行定位航行實驗。測試 時,隨機從NSEW 4個象限中任一象限將大鼠麵 向池壁放入水中進行觀察。若大鼠找到平台,並在 平台上停留5 s視頻追蹤係統停止記錄大鼠找 到平台前在水中遊泳的這段時間記為逃避潛伏期 (escape latency, EL)若大鼠60 s內未找到平台, 此時的EL記為60 s定位航行實驗連續測試5 d, 每天1次,記錄大鼠的EL第5天的測試結果作為 各組大鼠空間學習記憶能力。
  • 海馬 GR、5^mA、54IT2A 受體 mRNA 

RT~PCR法檢測。各組動物麻醉後斷頭取腦, 在冰台上快速分離海馬組織,置於-80 C冰箱保 存。使用的試驗器材均經滅活RNA酶處理。采用 TrizolRNA提取試劑盒提取標本中的總RNA,以 提取的總RNA為模板,按試劑盒說明將總RNA逆 轉錄成cDNA後檢測海馬中GR、5-HT1A、5-HT2A 受體mRNA的表達量。PCR擴增條件為:95 C10 min,95 C15 s,60 C20 s,72 C30 s,共 40 個循環。 建立雙標準曲線:取對照樣本cDNA, 10倍梯度稀釋 後,各取樣品2 ^L作為模板,然後用目的基因引物 和內參基因引物分別進行擴增。同時在75 ~90 C 進行溶解曲線分析,並繪製出目的基因和內參基因 的標準曲線。將各樣品cDNA進行4倍梯度稀釋, 稀釋後取2卟作模板,分別用目的基因引物和內參 基因引物進行擴增,同時在75 ~90 C分析溶解曲 線。采用 Prism 7000 型 Real~time Quantitative PCR 儀檢測,以管家基因甘油醛-3磷酸脫氫酶glyceral- dehyde-5~phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內 參,采用2-^法&]分析GR、5-HT1A、5~HT2A受體 的基因相對表達量。2- AACt法相對定量分析結果判 定:循環閾值。PCR引物序列:GAPDH上遊:5'- ACATGCCGCGTGGAGAAACCT-3',下遊:5'~GCCCA- GGATGCCCTTTAGTGG-3'; GR 上遊:5'-AGCAGAG- AATGTCTCTAC-3',下遊:5'~GGAATTCAATACTCAT- GGTC-3'; 5-HT1A 上遊:5'-TCACCTGCGACCTGTT- TATC-3',下遊:5'-GCTCCCTTCTTTTCCACCTT-3';5- HT2A 上遊:5'-CATCATGGCAGTGTCCCTAG-3',下 遊:5'-GGTAAATCCAGATCGCACAG-3'

AQ = Ct樣品均值Ct內參均值

AACt = AQ - (Q陰性對照樣品均值-Ct內參均值

1.6統計學方法采用SPSS 20. 0統計學軟件,實 驗結果以均數±標準差(x ± s)表示,組間比較采用 LSD法。P <0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組大鼠曠場實驗結果比較與對照組比較, 模型組大鼠在水平活動距離,直立、呆滯、修飾行為 次數,排便顆粒數等方麵均有顯著改變(P <0. 01); 龜鹿二仙膠(2.025 g • kg-1)和ying羊藿總黃酮(0.06 g • kg-1)PTSD大鼠曠場行為學指標均有顯著改 善(P <0.05 P <0.01)

 

PTSD的主要臨床表現包括創傷性事件的再體 驗、持續性高警覺、閃回和麻木。單一延chang刺激造模 方法包含心理應激(禁錮)、生理應激(強迫遊泳、yi醚麻醉),模擬出人類在自然環境中可能遭受到的

 

主要應激類型,能使大鼠出現驚恐行為、活動度降 低、學習和記憶能力減弱等多種PTSD樣的精神和 行為異常08 ,是目前較為成功的PTSD動物模型。

曠場實驗是檢測動物情緒喚醒水平、神經精神 變化的一種重要方法,對於量化分析實驗動物的精 神緊張度、警覺水平、焦灼狀態、環境適應能力等具 有重要意義°3。本研究中曠場實驗和拒俘反應實 驗的結果顯示,PTSD大鼠活動習性明顯改變、警覺 水平增高、環境適應能力明顯下降,始終表現出受驚 嚇逃避的情感應激反應;拒俘反應性呈現同步顯著 增強,容易激惹、掙紮行為明顯,衝突特性增強。 Morris水迷宮實驗結果顯示,PTSD大鼠逃避潛伏期 明顯延長,說明其學習能力顯著降低,存在著顯著的 認知功能障礙。

下丘腦-垂體-腎上腺hypothalamus—)ituitary~ad- renal gland, HPA)軸是參與應激反應並對應激進行 有效調控的神經內分泌係統。大量的研究已經證 實,PTSD患者存在著HPA軸功能的紊亂M。糖皮 質激素是HPA軸分泌的主要應激激素。 Quervain 011通過臨床試驗證實,提高體內糖皮質激素的水 平能夠抑製恐懼記憶的重現,從而減輕PTSD和恐 懼症患者的症狀。海馬是參與環境調控條件性恐懼 的重要腦區M ,同時也是HPA軸的重要調節位點。 海馬中的GR密度遠高於其他腦區013 ,糖皮質激素 通過與GR和鹽皮質激素受體結合發揮生物學效 應,GR在糖皮質激素的負反饋調節以維持HPA軸 功能平衡中起著重要的作用M

研究結果顯示,GR的表達水平升高015 ,本實驗 的結果也顯示PTSD大鼠海馬GR的表達增強,這與 PTSD糖皮質激素對HPA軸負反饋抑製作用增強是 致的;而GR的高表達可能與PTSD的情感行為障 礙、認知功能受損的發生發展過程有關。

關於PTSD的發病機製目前尚不明確,但大量 文獻結果表明,5~HT水平異常與PTSD的發生密切 相關,抗抑鬱藥5~HT重攝取抑製劑作為治療PTSD 的shou選方案M5~HT可能通過5-羥色胺轉運體、 5-HT受體以及與多巴胺、去甲腎上腺素等的相互作 用參與PTSD的發生017。海馬富含突觸後膜5- HT1A受體,5~HT1A受體和情感障礙關係非常密 切018。有研究表明,PTSD動物5-HT1A受體活性 與下丘腦促腎上腺皮質激素釋放激素有關,並且參 與杏仁核神經元凋亡過程13。研究表明,5~HT釋 放產生的焦慮效應主要產生於5-HT2A受體的激 活。此外,應激發生時5-HT還可能通過5-HT2A受 體發揮對HPA軸的調控作用020。單程長時應激2 周後,海馬腦區中5~HT2A受體親和力和受體數目 明顯增加;不可逃避刺激可使海馬、杏仁核以及下丘 腦5-HT2A受體表達呈升高趨勢020。臨床研究也 發現,5~HT2A受體拮抗劑萘法唑酮對戰爭相關的 PTSD患者具有明顯改善作用021。本實驗結果顯 示,PTSD大鼠海馬5~HT1A受體表達下降,而5- HT2A受體表達升高,說明單一延chang刺激應激可能 通過影響5-HT1A受體和5-HT2A受體mRNA的表 達,進而影響海馬對情緒反應、學習記憶等的調節功 能,參與PTSD的一係列精神情感障礙以及認知功 能減退等病理過程的發生。

PTSD屬於中醫情誌病的範疇。中醫認為,“腦 為髓之海’“腎主骨生髓’“腎藏精,在誌應恐”。因 此,腎可視為與恐相應的機體情誌活動的儲備之髒, 而涵藏於腎中的精氣則是情誌活動*的物質基 礎。腎中精氣充盈與否與機體情誌活動能否正常發 揮關係密切。基於中醫“腎藏精,在誌為恐”理論, 筆者認為,PTSD的發生是內因和外因協同作用的結 果。外因主要源於外界重大創傷性事件的強烈刺 激,內因主要由於稟賦不足或久病暗耗所致的腎精 不足,使機體應對外界刺激的整體能力下降。精足 則神旺,腎精不足,腦髓失養,則易引發恐懼、焦慮、 抑鬱、絕望等各種情誌活動的異常。腎藏誌應恐,驚 恐傷腎,氣機逆亂,則氣下精傷,誌意失藏,進而累及 五髒整體功能出現異常。因此,PTSD發病的中醫核 心病機凝煉為“腎精不足,封藏失職,誌氣衰敗”。 有研究發現,補腎方藥金匱腎氣丸可有效糾正地震 恐懼導致的子鼠神經發育遲緩等,對受恐懼影響的 大鼠其血清皮質酮、神經遞質(5~HTDA)等出現的 代謝紊亂具有調節作用022 ,可明顯改善PTSD患者 對單一西藥治療藥物的依賴性和核心症狀、抑鬱和 焦慮狀態023 ;滋補腎精方藥能提高“恐傷腎”雌性小 鼠的雌二醇、促卵泡激素和黃體生成素水平024 ;溫 補腎陽方藥能明顯改善PTSD大鼠Open-Field評 分、糖水攝取量、血漿17-)HCScAMP025

龜鹿二仙膠是中醫臨床治療各科虛證的基本 方,由鹿角膠、龜板膠、枸杞子、人參組成。鹿角膠能 補腎陽、生精血;龜板膠能滋陰潛陽,補血;人參大補 元氣而生津;枸杞子益精生血。諸藥合用,共奏補腎 填精、益氣養血、陰陽並補之功效。芭乐app在线安装前期研究工 作表明,龜鹿二仙膠能明顯抑製腎虛大鼠恐懼記憶 的形成,促進恐懼消退02。本研究發現,在行為學 方麵,龜鹿二仙膠能降低PTSD大鼠的高警覺水平 以及驚恐逃避情感反應,提高大鼠的學習記憶能力 和認知功能。此外,龜鹿二仙膠可以降低PTSD大 鼠海馬GR的表達水平,調節PTSD出現的HPA軸 功能紊亂;同時,龜鹿二仙膠還可通過升高PTSD大 鼠海馬5~HT1A受體表達水平和降低5~HT2A受體 表達水平,參與PTSD情感障礙的調節。

綜上,龜鹿二仙膠對PTSD具有良好的幹預治 療效應,其作用機理與改善情感行為和認知功能以 及調節海馬GR、5-HT1A5-HT2A受體表達有關。

 

聯係人
在線客服
用心服務 成就你我