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多功能誘咳引喘儀防治哮喘大鼠氣道炎症反應的作用
點擊次數:734 發布時間:2019-09-03

摘要:目的探討大豆肽soybean peptide, SP)通過下調Notch 1信號通路防治哮喘大鼠氣道炎症反應的作用機製。方 法將60SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組、地塞米鬆(DexamethaSone,Dex)0.5mg/kg組及大豆肽 600、300  150 mg/kg 劑量組。采用卵清蛋白Ovalbumin, OVA) + 氨氣化fAluminum hydroxide, Al (OH) 3)法複製大 鼠哮喘動物模型同時給予相應劑量的大豆肽進行幹預每天給藥1連續7 d末次給藥24 h後收集大鼠肺泡灌洗 yebroncho - alveolar lavge fluid, BALF),進行白細胞分類計數;取大鼠右下葉肺組織常規HE染色觀察肺組織病理學 改變及氣道重塑變化;采用逆轉錄PCRWestern - blot法檢測大鼠肺組織Notch 1Jagged 1Hes 1NF - kB mRNA 和蛋白表達水平。結果與哮喘模型組比較,大豆肽600 mg/kg劑量組大鼠BALF中的中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸 性粒細胞計數顯著降低P <0.01);大鼠肺組織病理損傷較模型組明顯改善,炎性細胞浸潤明顯減少;大鼠肺組織 Notch 1、agged 1Hes 1NF - kB mRNA和蛋白表達水平明顯下調P <0. 05,P <0. 01)。結論大豆肽對哮喘大鼠 炎症反應具有防治作用,其機製與下調Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF-kB信號通路有關。

關鍵詞:大豆肽;哮喘;Notch 1;炎症

支氣管哮喘(bronchial asthma, BA)簡稱“哮喘是一種常見的呼吸係統炎症性病症,往往伴有巨噬細

作者簡介:張玲(1981 -),女,本科,講師,研究方向:呼吸係統疾病防治 通訊作者:徐鬆濤E - mail:375874072@ qq. com 胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、淋巴細胞及中性粒細胞 等炎性細胞浸潤和氣道上皮細胞損傷,出現氣道平滑 肌痙攣,表現為喘息、呼吸困難、氣急、劇烈咳嗽等哮 喘症狀1Notch 1信號通路是調控細胞分化、遷移、 凋亡、增殖、炎症及腫瘤發生等生理病理過程的重要 信號分子12。研究報道Notch 1信號通路激活後可 誘導氣道成纖維細胞分化和增殖,促使氣管重塑,引
發免疫係統紊亂,誘導炎症反應,從而引發和促進支 氣管哮喘的發生發展。大豆肽soybean peptide, SP)是大豆經過酶解或微生物發酵分離提取得到的多 肽混合物,具有免疫調節、抗氧化、緩解疲勞等作 用。本研究觀察了大豆肽對哮喘大鼠的防治作 用,並以Notch 1信號通路為研究對象探討其抗炎平 喘分子機製。

1材料與方法

1.1實驗動物SD大鼠SPF雄性,w體 重180 ~200 g,湖南斯萊克景達實驗動物有限公司, 許可證號:SCXK (湘2011 -0003。將大鼠適應性飼 養5d,每籠4 ~5隻,3 ~4d更換1次墊料,調整室 內溫度為 22 ±2°C,濕度為 45% ~ 65%, 12 h/12 h 光照周期,常規飲食水。

1.2主要試劑大豆肽,河南省南街村(集團有限 公司;地塞米鬆碟酸鈉注射液Dexamethasone, Dex ) 國藥準字H41020055,鄭州卓峰製藥有限公司;卵清 蛋白Ovalbumin, OVA),美國 Sigma 公司;兔抗 Notch 1Jagged 1Hes 1、NF - kB 及卩-actin 抗體,羊抗兔 辣根過氧化物酶horseradish peroxidase, HRP)標記二 抗、增強型RIPA蛋白裂解液、彩色預染蛋白Marker (10 ~180 KDa)、PVDF 膜及 SDS - PAGE 凝膠製備試 劑盒等均購自武漢博士德生物工程有限公司;Trizol RNA 抽提試劑Easy - LoadPCR Master Mix (Blue, x)、BeyoRTII cDNA第yi鏈合成試劑盒等 由上海碧雲天生物技術有限公司南通分公司提供; PCR實驗所需引物由南京金斯瑞生物科技有限公司 設計合成。

1.3實驗動物分組及處理將SD雄性大鼠隨機分為6組每組10隻分別為:正常對照組、哮喘模型 組、地塞米鬆及大豆肽高、中、低劑量組。正常對照組 於實驗第1 d和第7 d腹腔注射生理鹽水0. 2 ml,其它 各組於實驗第1 d和第7 d腹腔注射致敏yeOVA 5 mg +氯氧化鋁200 mg +生理鹽水1 ml充分混懸)0. 2 ml第8 d,將大鼠置於誘咳引喘儀XR - YLS -8A 多功能誘咳引喘儀,上海芭乐app在线安装信息科技有限公司)中, 正常對照組大鼠用生理鹽水進行霧化激發,其它組用 1% OVA生理鹽水溶液進行霧化1次/d,每次30 min從霧化第2 d開始,於每次激發前正常對照組和 哮喘模型組灌胃生理鹽水,地塞米鬆組大鼠腹腔注射 地塞米鬆0. 5 mg/kg,大豆肽組大鼠分別灌胃大豆肽 600、00及150 mg/kg,連續激發和給藥7 d末次激 發24 h將大鼠麻醉快速取下肺組織收集肺泡灌 洗液,進行白細胞分類計數,然後將肺組織用生理鹽 水衝洗幹淨,取右下葉肺組織用於組織學檢測,剩餘 組織凍存於-80C超低溫冰箱中備用。

1.4大鼠肺組織形態學觀察取大鼠右下葉肺組 置於4%多聚甲醛溶液中固定48 h,經係列濃度乙 醇脫水後進行石蠟包埋、切片及HE染色,顯微鏡下 觀察肺組織病理學改變。

1.5 RT - PCR法檢測大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達水平取大鼠左上葉肺 組織約50 ~60 mg,置入盛有液氮的研缽中充分研磨 至粉末狀加入1. 5 ml Trizol充分混勻裂解消化12 000 rpm 4C離心20 min,吸取上清根據試劑盒說明 書操作步驟進行RNA抽提和逆轉錄反應。將逆轉錄 得到的cDNA進行PCR擴增實驗,各待測基因引物序 列見表1。

1.6 Western blot 法檢測大鼠肺組織 Notch 1Jagged 1、Hes1NF - kB蛋白表達水平取大鼠左下葉肺 組織約80〜100 mg,剪碎置於離心管中1.5 ml RIPA裂解液於冰上充分勻漿,然後再裂解約30min, 4C 12 000rpm離心15min,取上清移入1.5mlEP管 中,進行蛋白定量,並調整濃度一致。將上清樣品與 蛋白上樣緩衝液等體積混勻後煮沸5min,以25 ^l/

孔上樣進行SDS-PAGE電泳轉印至PVDF依 次進行封閉、一抗、二抗孵育、顯色及拍照等步驟,以 p - actin 為內參,分析待測蛋白相對表達值。

1.7統計學處理用SPSS18.0統計軟件進行數據 處理,數據以Mean 盨D表示,多組間的兩兩比較采 用單因素方差分析one - way ANOVA)LSD - t 檢 驗,檢驗水準為a =0.05。

 

2 # 中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞數明顯增多

(P<0.001);與哮喘模型組比較,大豆肽600、300 2.1大豆肽對哮喘大鼠BALF中白細胞分類計數的 mg/kg組大鼠BALF中中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸 影響與正常對照組比較,哮喘模型組大鼠BALF 性粒細胞數顯著降低P <0.001)結果見表2。

組別

濃度mg/kg)

中性粒細胞107/L)

淋巴細胞107/L)

嗜酸性粒細胞107/L)

正常對照

-

8.04±1.36

19.53?.64

3.53?.45

哮喘模型

-

20.96 ?.53b

45.24 ?.47b

12.09?.69b

地塞米鬆

0. 5

9.71?.17d

23.72?.55d

4.43?.16ad

大豆肽高劑量

600

11.61?.07c

30.88 ?.89ac

5.61?.40bd

大豆肽中劑量

300

14.11?.47ac

35.98 ?.08bc

7.49?.63bc

大豆肽低劑量

150

18.46?.59b

43.62?.41b

10.49?.80b

F

 

23.267

23.032

49.249

P

 

<0.001

<0.001

<0.001

2大豆肽對哮喘大鼠BALF中白細胞分類計數的影響x 眘= 10)

注:與正常對照組比較,P <0.05, bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, dP <0.01

 

2.2大豆肽對哮喘大鼠肺組織病理學變化的影響 增厚,管腔變窄,部分有膠原沉積;大豆肽600、00

正常對照組大鼠肺組織結構完整,肺泡無萎縮塌陷, mg/kg組大鼠肺組織病理損傷較模型組明顯改善,炎

氣道內壁未見增厚,偶見炎性細胞浸潤;哮喘模型組 性細胞浸潤減少,肺泡結構較為完整,但仍不能恢複

&:正常對照組沁:哮喘模型組;:地塞米鬆組;3:大豆肽600瓜呂八呂;6:大豆肽300瓜呂八呂:大豆肽150瓜呂八呂大鼠肺組織可見多量、散在的炎性細胞浸潤,氣道壁 至正常。

1大豆肽對哮喘大鼠肺組織病理形態的影響X200)

2.3大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達水平的影響與正常對 照組比較,哮喘模型組大鼠肺組織Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA表達水平明顯上調P < 0.001);與哮喘模型組比較,大豆肽600 mg/kg組大

鼠肺組織 Notch 1、agged 1、Hes 1 及 NF - kB mRNA 表達水平顯者下調P <0. 001)結果見圖2、表3。 2.4大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB蛋白表達水平的影響與正常對照 組比較,哮喘模型組大鼠肺組織Notch 1Jagged 1、

Hes 1NF - kB蛋白表達水平明顯上調(P < 鼠肺組織Notch 1Jagged 1Hes 1及NF - kB蛋白表

3大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1NF - kB mRNA表達水平的影響(x  s, n = 10)0.001);與哮喘模型組比較,大豆肽600 mg/kg組大 達水平顯著下調(P <0.001)。結果見圖3、表4。

組別

濃度mg/kg)

Notch 1/ p - actin

Jagged 1/ p - actin

Hes 1/ p - actin

NF - kB / p - actin

正常對照

-

0.167?.029

0.249 ?.035

0.210?.039

0.116?.020

哮喘模型

-

0.458 ?.037b

0.669 ?.050b

0.435 ?.060b

0.805 ?.037b

大豆肽高劑量

600

0.317?.042ac

0.313?.039d

0.291?.018ac

0.564 ?.044bd

F

 

47. 721

88.186

21.273

293.292

P

 

<0.001

<0.001

0. 002

<0.001

注:與正常對照組比較,P <0.05, bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, dP <0.01

 

 

4大豆肽對哮喘大鼠肺組織Notch 1、Jagged 1、Hes 1NF- kB蛋白表達水平的影響(x  s, n = 10)

組別

濃度mg/kg)

Notch 1 /p - actin

Jagged 1 /p - actin

Hes 1 /p - actin

NF - kB / p - actin

正常對照

-

0.189 ?.040

0. 365 ?0. 043

0. 264 ?0. 027

0.258 ?.056

哮喘模型

-

0. 775 ?0. 042b

0.869 ?.047b

0.684 ?.046b

0. 908 ?0. 042b

大豆肽高劑量

600

0.552?.032bd

0.601?.030bd

0.551?.050bc

0.736 ?.058bc

F

 

178. 316

115.681

78. 753

123. 500

P

 

0. 000

0. 000

0. 000

0. 000

注:與正常對照組比較,P <0.05, bP <0.01;與哮喘模型組比較,P <0.05, dP <0.01

3討論

支氣管哮喘是多種炎性細胞浸潤或炎症介質參 與的以氣道高反應性及重塑為特點,伴有氣管痙攣、 呼吸困難、咳嗽及喘息等症狀的呼吸係統炎症性疾 病&]。在本研究中,與正常對照組比較,哮喘模型組 大鼠BALF中中性粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞 計數明顯增多,且HE病理切片觀察到氣管壁增厚, 管腔變窄,可見多量散在炎性細胞浸潤,以上結果與 哮喘的炎症變化及病理學改變相一致,表明OVA致 哮喘大鼠模型成功建立。同時,與哮喘模型組比較,大豆肽600、00 mg/kg可減少哮喘大鼠BALF中中性 粒細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞數,且肺組織病理 學損傷得到明顯改善,提示大豆肽可減輕哮喘大鼠氣 道炎症,改善肺組織病理性損傷,對哮喘有一定的防 治作用,但大豆肽防治哮喘的具體機製尚不明確。研 究表明,炎症是導致哮喘患者或哮喘動物模型氣道增 殖、氣管重塑及肺組織損傷等病理變化的重要因素, 控製炎症反應是緩解哮喘症狀的重要措施8 ,為此本 研究以 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF - kB _炎症信 號通路為研究靶點,探討大豆肽抗炎平喘分子機製。

哮喘的發生發展與炎症細胞釋放炎性介質(如

IL-lpIL-6TNF-a等)激活Notch 1信號通路 密切相關9 — 10]Notch 1信號通路由其相應的配體 (Jagged 1)、受體(Notch 1)及上下遊信號效應分子 (Hes 1、NF - kB)等組成,其調節異常可介導哮喘炎 症的發生,參與氣道增殖、氣管重塑等病理過程[11]在炎症刺激作用下Jagged 1與Notch 1相互結合, Notch 1 路即被激活高表達 Notch

(notch intracellular domain, NICD)被釋放,其下遊 Hes 1等關鍵靶基因被啟動從而上調氣道上皮膠原蛋白 的表達,誘發氣道上皮下增殖和纖維化,引起哮喘氣 道重塑等病理性損傷[12-13]NF - kBNotch 1信號 通路調控巨噬細胞介導的炎症反應主要靶分子之一, Notch 1通路活化後,激活I - kB激酶(I - kB kinase, IKK), IKK作用於I - kB使其發生磷酸化,使得NF - kB/ I - kB二聚體複合物解離,NF - kB發生磷酸化 並通過核膜轉移進入核內,與DNA特異性結合位點 相互作用,快速啟動IL - 6、IL - 5及TNF - a等靶基 因的轉錄,生成相應的炎症因子促使炎症反應的發 生[14]。同時,生成的炎症因子又是Notch 1和NF - kB 的活化劑,進一步激活 Notch 1/Jagged 1/Hes 1/NF -kB信號通路,如此周而複始使炎症反應持續放大 和擴散,使哮喘症狀不斷加重,誘發氣道內皮細胞增 殖和氣管重塑等病理性損傷[15]。本研究發現,大豆 肽600 mg/kg可使哮喘大鼠肺組織Notch 1Jagged 1、 Hes 1及NF - kB mRNA和蛋白表達水平明顯下降, 提示其抗炎平喘機製與下調Notch 1/Jagged 1/Hes 1/ NF-kB信號通路有關。

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