產品列表PRODUCTS LIST

首頁 > 技術與支持 > 轉棒實驗檢測小鼠抗疲勞能 力
轉棒實驗檢測小鼠抗疲勞能 力
點擊次數:2113 發布時間:2019-08-26

摘要:【目的】比較雌、雄海馬對小鼠抗疲勞和改善記憶障礙的不同作用。【方法】轉棒實驗檢測小鼠抗疲勞能 力,將小鼠分3組,1組喂食普通飼料,另外2組分別喂食含有質量分數0.22%雌、雄海馬的飼料,共喂食6周。 跳台實驗檢測小鼠記憶能力將小鼠為4組正常組與乙醇組喂食普通飼料另外2組分別喂食含有質量分數0.22% 雌、雄海馬的飼料,共喂食6周。體積分數30%乙醇灌胃乙醇組和雌、雄海馬組誘導小鼠記憶損傷模型結果】 抗疲勞實驗中,與對照組相比,喂食雄海馬的小鼠在棒時間顯著延長(屍<0.05),其血清中乳酸含量顯著降低P <0.05);而喂食雌海馬的小鼠在棒時間和血清乳酸含量均無明顯改變。乙醇記憶損傷實驗中,與對照組相比,模 型組小鼠跳下平台的潛伏期顯著下降(屍<0.01),錯誤數(次)顯著升高(屍<0.01);與模型組相比,喂食雄海 馬的小鼠跳下平台的潛伏期顯著升高(屍<0.05),錯誤數(次)顯著減少(屍<0.05),腦組織中的乙酰膽堿酯酶 活性顯著降低(屍<0.05);而喂食雌海馬的小鼠上述指標均無改變結論】在增強小鼠抗疲勞能力和改善記憶方 麵,雄海馬的功效顯著而雌海馬無效。

關鍵詞:雌、雄海馬;抗疲勞;gai善記憶

 

隨著現代生活節奏的加快,疲勞的產生對人們 生活質量產生了越來越大的影響。延緩疲勞發生, 迅速消除疲勞,對人們身體健康極為重要[1]。學習 記憶是大腦重要功能之一,也是人類賴以生存和進 化的關鍵。由外力、環境汙染以及酒精等引起的記 憶損傷,特別是因酒精引起的記憶損害越來越多, 會嚴重危及人類的正常生活工作,造成嚴重經濟負 擔。由於海洋的獨特環境,許多海洋藥物具有 的活性和特殊的藥理作用機製,在抗疲勞和記憶改 善方麵的作用日益受到人們的重視[2]

海馬入藥曆史悠久,藥理作用廣泛,除性激素 樣作用[3-4]外,還具有抗炎[5]、抗氧化、抗疲勞和抗 癌[6]、抗抑鬱[7]等作用。三斑海馬能顯著延長小鼠 負重遊泳時間,減少運動過後的乳酸生成並加速乳 酸代謝,其抗疲勞效果優於人參[8]。“深海龍”是一 種含有海馬有效成分的水丸,服用後能顯著提高人 體無氧功率、定量負荷以及極限負荷工作能力[9]。 藥理研究發現海馬水、醇提取物能在一定程度上改 善記憶[10]。小鼠妊娠晚期,一次性灌胃穀氨酸單鈉, 可明顯降低60日齡仔鼠Y迷宮學習記憶能力[11]。 從三斑海馬中分離出的一種肽類初製劑,可拮抗穀 氨酸單鈉的上述作用[12]。三斑海馬中分離出的一種 小分子多肽能抵抗Ap誘導的神經毒性,有望治療 老年癡呆[13]。此外,海馬富含DHAEPA-3多不 飽和脂肪酸對大腦有很好保護作用的成分[14]

目前對《中國藥典》2015版收錄的5種高藥用 價值海馬的研究,主要是三斑海馬,但三斑海馬養 殖較為困難,難以滿足市場需求。而線紋海馬因抗 病能力強、存活率高、生長速率快優點[15],成為近 年來的養殖shou選。同時線紋海馬較三斑海馬異亮氨 酸、亮氨酸、甲硫氨酸以及精氨酸含量高,這些成 分對維護機體健康,增強免疫力有重要作用[16]。目 前關於線紋海馬的研究主要集中在抗炎[17]方麵,且 傳統中藥習慣將線紋海馬雌雄配對入藥[18],單雄性 或單雌性海馬功效研究尚未見報道。本研究以單雌 性和單雄性海馬飼喂小鼠,利用轉棒實驗和急性乙 醇記憶損傷模型,分析雌、雄海馬對小鼠增強疲勞 耐受和改善記憶的功效,並通過測定血清中乳酸 (LA)含量反映小鼠疲勞程度,腦組織中乙酰膽堿 酯酶AChE)以及乙酰膽堿轉移酶ChAT)活性 反映小鼠與學習記憶有關的膽堿能係統變化,以期 進一步闡明線紋海馬功效的機製,為線紋海馬保健 品和藥品開發研究提供依據。

1材料與方法

1.1材料

無特定病原體SPF級)六周齡雄性昆明種小 鼠,體質量22〜24 g購自濟南朋悅實驗動物繁育 有限公司(合格證號:37⑻92⑻008874 )。小鼠飼 養於SPF級動物房,溫度(23±1 )C,濕度(50±10 )%, 12 h光照(7: 00—19:⑻),自由飲食和攝水。小 鼠適應環境7d後開始實驗,此時小鼠體質量均值 為33 g線紋雌海馬、線紋雄海馬,由深圳市萬騏 海洋生物科技有限公司提供。YLS-4C轉棒式疲勞 儀,濟南益延科技發展有限公司;XR-3TB跳台實 驗係統,上海芭乐app在线安装信息科技有限公司;高速冷凍台 式離心機,Beckman公司;RT-61⑻酶標儀,Rayto

公司。無水乙醇,成都市科龍化工試劑廠。ELISA 試劑盒LAAChEChAT產品批號分別為 20170705536T、 20170711258T、 20170702163T

江蘇雨桐生物科技有限公司提供。海馬飼料由海馬 粉末與普通粉末飼料按比例混合均勻,混合後的飼 料4C下儲存,小鼠食用飼料每天更新,避免海馬 氧化。

 

1.2萬法

1.2.1實驗分組海馬抗疲勞實驗共分3(《 = 15):對照組飼喂普通飼料,雌海馬組飼喂質量分 數0.22%的雌海馬飼料,雄海馬組飼喂質量分數 0.22°%的雄海馬飼料。海馬記憶改善實驗共分4組 (« = 15):對照組以及乙醇組飼喂普通飼料,雌海 馬組飼喂質量分數0.22%的雌海馬飼料,雄海馬組 飼喂質量分數0.22%的雄海馬飼料。海馬粉末不溶 於水,故采取拌飼料喂食的方式,該方法成熟,應 用廣泛[19]。兩個實驗均喂食海馬飼料6周,記錄初 始體重,之後每周末稱重一次。

1.2.2小鼠轉棒實驗[20]先進行為期3d的適應性 預實驗,每天將小鼠放置在轉棒疲勞儀上,設置轉 棒疲勞儀轉速20 r/min時間10 min如有小鼠中 途掉落,則將小鼠放回轉棒上繼續適應。正式實驗 中,設定轉速40 r/min記錄5 min內小鼠從開始 到掉棒的時間。本實驗為一次性測試結果。

1.2.3跳台實驗[21]體積分數30%的乙醇以10 mL/kg的劑量在實驗前1 h灌胃乙醇組和雌、雄海 馬組,造成急性乙醇中毒所致記憶損傷造模。跳台 實驗時,將小鼠放置在平台上,自由探索試驗箱3 min,後將小鼠放置在箱內銅柵上銅柵通電(30 mA 恒流)以刺激小鼠找到平台。24 h後正式測試,記 錄5 mm內小鼠次跳下平台的時間,即潛伏期, 以及5 mm內小鼠跳下平台的總數(次),即錯誤數 (次)。本實驗為一次性測試結果。

1.2.4樣品采集轉棒實驗結束30 min後,小鼠斷 頭頸部取血全血靜置0.5 h以轉速3⑻0 r/min心10 min保存血清於-80 °C冰箱。跳台實驗結束 24 h後,小鼠斷頭,迅速將全腦剝離,液氮冷凍後 保存於-80 C冰箱。

1.2.5生化指標測定根據ELISA試劑盒說明書, 測定抗疲勞實驗小鼠血清LA含量,記憶障礙實驗 小鼠全腦AChEChAT活性。

1.2.6數據處理所有數據均用均值±標準誤差 (Y盨E)表示,SPSS 19 統計分析,Graphpad 

1.2萬法

1.2.1實驗分組海馬抗疲勞實驗共分3(《 = 15):對照組飼喂普通飼料,雌海馬組飼喂質量分 數0.22%的雌海馬飼料,雄海馬組飼喂質量分數 0.22°%的雄海馬飼料。海馬記憶改善實驗共分4組 (« = 15):對照組以及乙醇組飼喂普通飼料,雌海 馬組飼喂質量分數0.22%的雌海馬飼料,雄海馬組 飼喂質量分數0.22%的雄海馬飼料。海馬粉末不溶 於水,故采取拌飼料喂食的方式,該方法成熟,應 用廣泛[19]。兩個實驗均喂食海馬飼料6周,記錄初 始體重,之後每周末稱重一次。

1.2.2小鼠轉棒實驗[20]先進行為期3d的適應性 預實驗,每天將小鼠放置在轉棒疲勞儀上,設置轉 棒疲勞儀轉速20 r/min時間10 min如有小鼠中 途掉落,則將小鼠放回轉棒上繼續適應。正式實驗 中,設定轉速40 r/min記錄5 min內小鼠從開始 到掉棒的時間。本實驗為一次性測試結果。

1.2.3跳台實驗[21]體積分數30%的乙醇以10 mL/kg的劑量在實驗前1 h灌胃乙醇組和雌、雄海 馬組,造成急性乙醇中毒所致記憶損傷造模。跳台 實驗時,將小鼠放置在平台上,自由探索試驗箱3 min,後將小鼠放置在箱內銅柵上銅柵通電(30 mA 恒流)以刺激小鼠找到平台。24 h後正式測試,記 錄5 mm內小鼠次跳下平台的時間,即潛伏期, 以及5 mm內小鼠跳下平台的總數(次),即錯誤數 (次)。本實驗為一次性測試結果。

1.2.4樣品采集轉棒實驗結束30 min後,小鼠斷 頭頸部取血全血靜置0.5 h以轉速3⑻0 r/min心10 min保存血清於-80 °C冰箱。跳台實驗結束 24 h後,小鼠斷頭,迅速將全腦剝離,液氮冷凍後 保存於-80 C冰箱。

1.2.5生化指標測定根據ELISA試劑盒說明書, 測定抗疲勞實驗小鼠血清LA含量,記憶障礙實驗 小鼠全腦AChEChAT活性。

1.2.6數據處理所有數據均用均值±標準誤差 (Y盨E)表示,SPSS 19 統計分析,Graphpad 

1.2萬法

1.2.1實驗分組海馬抗疲勞實驗共分3(《 = 15):對照組飼喂普通飼料,雌海馬組飼喂質量分 數0.22%的雌海馬飼料,雄海馬組飼喂質量分數 0.22°%的雄海馬飼料。海馬記憶改善實驗共分4組 (« = 15):對照組以及乙醇組飼喂普通飼料,雌海 馬組飼喂質量分數0.22%的雌海馬飼料,雄海馬組 飼喂質量分數0.22%的雄海馬飼料。海馬粉末不溶 於水,故采取拌飼料喂食的方式,該方法成熟,應 用廣泛[19]。兩個實驗均喂食海馬飼料6周,記錄初 始體重,之後每周末稱重一次。

1.2.2小鼠轉棒實驗[20]先進行為期3d的適應性 預實驗,每天將小鼠放置在轉棒疲勞儀上,設置轉 棒疲勞儀轉速20 r/min時間10 min如有小鼠中 途掉落,則將小鼠放回轉棒上繼續適應。正式實驗 中,設定轉速40 r/min記錄5 min內小鼠從開始 到掉棒的時間。本實驗為一次性測試結果。

1.2.3跳台實驗[21]體積分數30%的乙醇以10 mL/kg的劑量在實驗前1 h灌胃乙醇組和雌、雄海 馬組,造成急性乙醇中毒所致記憶損傷造模。跳台 實驗時,將小鼠放置在平台上,自由探索試驗箱3 min,後將小鼠放置在箱內銅柵上銅柵通電(30 mA 恒流)以刺激小鼠找到平台。24 h後正式測試,記 錄5 mm內小鼠次跳下平台的時間,即潛伏期, 以及5 mm內小鼠跳下平台的總數(次),即錯誤數 (次)。本實驗為一次性測試結果。

1.2.4樣品采集轉棒實驗結束30 min後,小鼠斷 頭頸部取血全血靜置0.5 h以轉速3⑻0 r/min心10 min保存血清於-80 °C冰箱。跳台實驗結束 24 h後,小鼠斷頭,迅速將全腦剝離,液氮冷凍後 保存於-80 C冰箱。

1.2.5生化指標測定根據ELISA試劑盒說明書, 測定抗疲勞實驗小鼠血清LA含量,記憶障礙實驗 小鼠全腦AChEChAT活性。

1.2.6數據處理所有數據均用均值±標準誤差 (Y盨E)表示,SPSS 19 統計分析,Graphpad 

圖。參數數據均采用單因素方差分析,進行LSD檢 驗,非參數數據(跳台潛伏期和抗疲勞行為實驗) 均米用 Kruskal-Wallis 分析,進行 Wilcoxon- Mann-Whitney U-test檢驗。所有檢測指標《 = 15。

2實驗結果

 

2.1雌、雄海馬對小鼠體質量影響

圖1可知,實驗前,各組小鼠體質量沒有差異 (P>0.05)。飼養6周後,各組小鼠的體質量均有 增加,但與對照組相比,飼喂雌、雄海馬的小鼠體 質量均無顯著差異(戶>0.05),說明雌、雄海馬對 小鼠的正常生長並無影響。

 

2.2雌、雄海馬飼喂對小鼠抗疲勞耐受時間影響

小鼠從開始到掉棒的持續時間越長,表示小鼠 耐受時間越長,抗疲勞能力越強。圖2顯示,與對 照組相比,雌海馬組的耐受時間無顯著差異(戶> 0.05 )雄海馬組的耐受時間則顯著升高(醜 =7.353, P<0.05 ),說明僅雄海馬能增強小鼠抗疲勞能力。

2.3雌、雄海馬飼喂對小鼠血清中乳酸LA影響

圖3顯示,雄海馬對血清乳酸水平有顯著效果 (F(2,42)=3.465, P<0.05)。與對照組相比,雌海 馬組的血清LA水平無顯著差異P>0.05 ),雄海 馬組的血清LA水平則顯著降低P<0.05 );與雌 海馬組相比,雄海馬組的血清LA水平也顯著降低 (P<0.05)結果表明雄海馬能有效降低運動疲勞 後小鼠體內LA含量。

2.4雌、雄海馬對小鼠跳台潛伏期和錯誤數(次) 影響

圖4顯示,雄海馬對乙醇誘導的跳台潛伏期有 顯著改善效果(萬=29.364, P<0.01)。與對照組相 比,乙醇組的潛伏期顯著降低P<0.01);與乙醇 組相比雌海馬組的潛伏期無明顯升高P>0.05)雄海馬組的潛伏期則顯著升高(P<0.01 )表明30% 乙醇灌胃能造成小鼠記憶損傷,雄海馬能顯著改善 這種記憶障礙,而雌海馬無效。

 

4雌、雄海馬對小鼠跳台潛伏期的影響 Effect of female and male sea horse on step-down latency in mice

圖5顯示,海馬對乙醇誘導的跳台錯誤數(次) 有顯著改善效果F(3,56)=12.315, P<0.01)。與對 照組相比,乙醇組的錯誤數(次)顯著升高P< 0.01 );與乙醇組相比,雌、雄海馬組的錯誤數(次) 均顯著降低P<0.05)。表明對於乙醇造成的記憶 損傷,雌、雄海馬能部分進行改善。

  

 

**, VS 對照組 P<0.01; #, VS 乙醇組 P<0.05
**, VS control group P<0.01; #, VS female sea horse group P<0.05

5雌、雄海馬對小鼠跳台錯誤數(次)的影口向
Fig. 5 Effect of female and male sea horse on the number of
errors in step-down test in mice

2.5雄海馬對小鼠腦內乙酰膽堿酯酶AChE和 乙酰膽堿轉移酶ChAT活性影響

圖6顯示,海馬對乙醇誘導的AChE活性有顯 著改善效果F(3,56)=13.5 3 5, P<0.05)。與對照組 相比,乙醇組AChE活性顯著升高P<0.01);與 乙醇組相比,雄海馬組AChE活性顯著降低P< 0.05)結果表明,乙醇能導致小鼠腦內AChE活性 上升,雄海馬能逆轉這一影響

6雌、雄海馬對小鼠腦內乙酰膽堿酯酶活性的影響
Fig. 6 Effect of female and male sea horse on the brain
activity of AChE in mice

圖7顯示,與對照組相比,乙醇誘導使得腦內 ChAT 活性顯著降低F(3,56) =5.656,屍<0.05);但 是與乙醇組相比,雌、雄海馬兩個組ChAT活性均 沒有變化(屍>0.05)。結果表明,乙醇造成的記憶 損傷會使腦內ChAT活性下降,但是雌、雄海馬對 這一變化並無改善作用。

3討論

運動耐力是反映機體疲勞直jie客觀的指標, 運動耐力的增強是抗疲勞能力增強的有力表現。 小鼠轉棒實驗是一種強迫全身消耗性實驗,其運動 時間的長短是衡量疲勞的一個指標[22]。乳酸是機體 在無氧條件下進行糖代謝的終產物,劇烈運動時機 體會產生大量乳酸,乳酸的積累會導致機體疲勞, 可反映機體疲勞程度[23]。在本研究中,雄海馬表現 出對血乳酸的清除作用,提高了機體對氧的利用能 力,降低了無氧酵解程度,從而延長了小鼠運動耐 受時間。彭汶鐸等[24]也發現小鼠連續14 d灌胃海馬 酶解提取物,在一次性運動和遞增運動量疲勞模型 中,小鼠血清中乳酸含量均顯著降低。但是飼喂雌 海馬的小鼠,其耐受時間與血清乳酸含量與對照組 相比,並無明顯變化,證明單獨的雌海馬不能改善 小鼠的運動機能,沒有抗疲勞作用。

跳台實驗是檢測動物學習記憶能力的常用方 法,跳台潛伏期和錯誤數(次)是評價動物學習記 憶的重要指標。潛伏期長,錯誤數(次)少,表明 動物的學習記憶能力強。本研究中,30°%乙醇灌胃 對小鼠的學習記憶能力造成了損傷。一次性飲人過量乙醇,能引起中樞神經係統由興奮轉為抑製狀 態,首先作用於大腦皮層,然後累及皮層下中樞和 小腦,導致記憶力下降[25]。乙醇對中樞神經係統的 損傷機製比較複雜,其中之一是對膽堿能係統的影 響[26]。而中樞膽堿能係統則與學習記憶密相關,膽 堿能係統的重要神經遞質乙酰膽堿ACh),其釋放 量隨著學習與記憶、探究行為等認知活動的發生而 隨之改變。ChATACh的合成起著催化作用,而 AChE則參與腦內ACh的分解,使神經遞質對突觸 後膜的興奮作用終止,保證神經傳遞正常。在大腦 內,ChATAChE共同維持著ACh的動態平衡[27]。 由於ACh性質極不穩定,容易水解,故通過檢測 ChATAChE的活性間接來反映ACh的含量。從 實驗結果可知,乙醇組ChAT活性降低,AChE活 性升高,即ACh分解加快而合成減少,AChE總體 水平降低,學習記憶受損。從行為上看,飼喂雄海 馬的小鼠其學習記憶有所改善,潛伏期增加,錯誤 數(次)減少;而飼喂雌海馬的小鼠,學習記憶能 力並未改善。生化指標則顯示,飼喂雄海馬的小鼠 其腦內AChE活性與乙醇組相比顯著降低ChAT 活性則無明顯變化,提示雄海馬對學習記憶的改善 可能是通過抑製ACh分解而非加速其合成,此外在 不同記憶損傷模型小鼠中,利用不同中藥如夏天無 和刺五加,均顯示可通過抑製AChE來達到記憶改 善的效果[28-29];由於雌海馬未能改善乙醇造成的學 習記憶損傷,所以與乙醇組相比,飼喂雌海馬的小 鼠其腦內ChATAChE活性也無改變。

本研究存在以下兩點不足:1.評價抗疲勞經典 藥效學實驗有轉棒疲勞和負重遊泳,評價記憶改善 的有跳台,避暗及水迷宮實驗。目前本實驗隻各米 用了其中一種方法。2.實驗中所用海馬為粉末粗材 料,應該找出其中的有效成分進行實驗。接下來筆 者及研究團隊將對雌、雄海馬成分進行更深人的分 析,優化海馬提取物,完善實驗方案,為更準確、 更好地利用海馬資源提供理論依據。

4結論

雄海馬可以通過降低體內乳酸含量,增強小鼠 的抗疲勞能力;通過抑製乙酰膽堿酯酶,改善小鼠 的學習記憶能力;而單獨的雌海馬則沒有上述功 能。雄海馬在抗疲勞和改善記憶方麵的*而 雌海馬無效。

聯係人
在線客服
用心服務 成就你我