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Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力
點擊次數:3717 發布時間:2019-08-12

補腎填髓方對阿爾茨海默病模型大鼠學習記憶
能力及線粒體氧化應激的影響

 

目的觀察補腎填髓方對阿爾茨海默病Alzheimers disease, AD)模型大鼠學習記憶能力及線粒體氧化應激的影響方法50隻大鼠先用Y迷宮初篩再按曠場實驗得分隨機分成正常組模型組假手術組中藥組西藥組假手術組兩側側腦室注 射P澱粉樣蛋白AP)424,佘下除正常組外均以雙側側腦室注射(AP)1^複製AD模型造模後中藥組灌服補腎填髓方西藥組灌服 多奈呱齊其他組灌服等容量生理鹽水連續幹預28 dMorris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力酶聯免疫吸附方法(ELISA)檢測大鼠 腦皮質及血清超氧化物歧化酶superoxide dismufase, SOD)活性硫代巴比妥酸法(TBA)檢測大鼠腦皮質及血清丙二醛(malondi- aldehyde, MDA)活性透射電鏡觀測海馬線粒體超微結構結果與模型組比較中藥組和西藥組大鼠水迷宮逃避潛伏期縮短在原 平台象限遊泳時間及距離的百分比增加差異均有顯著統計學意義(P<0.05P<0.01)。與模型組比較中藥組SOD活性升高MAD 活性減低(P<0.05P<0.01);西藥組的SOD活性升高MDA活性降低(P<0.01);中藥組及西藥組的海馬線粒體超微結構病理損害改 善結論補腎填髓方可以改善AD大鼠的學習記憶能力其機製可能與改善線粒體氧化應激有關

關鍵詞阿爾茨海默病補腎填髓方氧化應激線粒體

 

阿爾茨海默病Alzheimers disease, AD)是與 年齡相關的中樞神經係統退行性疾病以進行性記 憶下降及認知損傷為特點[1]由於人口老齡化目前 世界範圍內AD患病人數已經達到4 400[2]給社 會帶來沉重負擔AD的病因和發病機製複雜且並 不完全清楚現在的治療藥物不能完全滿足臨床需 要並且費用昂貴還存在肝毒性腹瀉惡心嘔吐頭暈等不良反應[3]因此研究療效更確切副作用 更少的AD治療藥物非常緊迫近年來大量文獻研 究報道AD與氧化應激聯係緊密改善氧化應激可 以明顯改善AD[4-6]補腎填髓方是根據中醫學理論 腎虛髓虧”,基於經典方劑孔聖枕中丹(《千金方化裁而成相關研究證實補腎填髓方藥能有效延緩 癡呆早期患者大腦結構的萎縮改善其認知及記憶 功能'但其作用機製並不十分明確本研究擬以 AD模型大鼠為實驗對象從線粒體的氧化應激角 度探討補腎填髓方抗AD的作用機製

1材料與儀器

1.1實驗動物

90隻健康雄性清潔級SD大鼠體質量(180±20)g購自斯萊克景達實驗動物有限公司許可證號:SYXK (2010-0013;實驗動物來源證號430047000飼 養於湖南省人民醫院動物實驗室所有動物飼養在 室溫22~25濕度40%~60%條件下以普通飼料 喂養自由進食飲水將大鼠觀察性飼養1周後進行 Y迷宮實驗初篩

1.2實驗藥物試劑及儀器設備

補腎填髓方由石菖蒲10 g遠誌10 g何首烏 15 gyin羊藿15 g龜板20 g龍骨20 g組成鹽酸 多奈呱齊片衛材藥業有限公司批號1611013ApW2Sigma 公司批號A4559A^42-1Sigma 公司

批號:A2201(以無菌雙蒸水將ApM2AP42-1配製成 濃度為2 pg/pL,置於37 t恒溫箱孵育7 d保存於 4 °C 冰箱備用)。丙二醒(malondialdehyde,MDA)試劑 盒南京建成批號A003-1超氧化物歧化酶(su-peroxide dismufase, SOD)試劑盒 武 漢華美 批號 P03037347大鼠腦立體定位儀美國K0PF(Model- 900)。Morris水迷宮上海芭乐app在线安装(XR-XM101)Y迷宮上海軟隆(BW-MYM103)。透射式電子顯微鏡美國 FEI 公司(Tecnai G2 Spirit)。

2方法

2.1 AD大鼠模型的複製及幹預

根據參考文獻[8]Y型迷宮初篩剔除先天愚 鈍的大鼠隨後依據曠場實驗水平運動得分將大鼠 分為正常組假手術組模型組西藥組中藥組每 組10隻參照Xi[9]方法複製AD模型除正常組 夕卜,各組大鼠以10%水合氯醛350 mg/kg)腹腔注射 麻醉後俯臥固定於腦立體定位儀常規備皮消毒頭 頂正中切開皮膚找到大鼠前囟結合大鼠腦立體 定向儀圖譜[10]及預實驗結果在大鼠兩側側腦室(位 置前囟後1 mm矢狀縫向左右側勞開1.5 mm4.6 mm)用針頭鑽開顱骨假手術組兩側側腦室 注入AP42-1 5 pL其餘實驗組緩慢注入ApM2 5 pL注入時間均為5 min留針時間5 min注射完畢後 縫合皮膚局部紅黴素外塗防感染

正常組不灌胃其他組造模後隔天開始灌胃根 據人與大鼠換算係數0.018,以大鼠體質量200 g成 人體質量60 kg為參考西藥組按0.33 mg/(kgd)、中 藥組按生藥量8.1 g/(kgd)的劑量灌胃給予藥液 8 mL/(kgd)。模型組和假手術組灌服等容量生理鹽 水連續給藥4

造模成功標準[8]:造模結束後第15,對大鼠再次進行Y型迷宮篩選15次測試中正確次數 比造模前下降1/3者為造模成功共剔除死亡大鼠 5造模失敗3將存活的成功模型納人下一步 實驗其中假手術組8模型組7中藥組9西藥組8正常組10成模率80%並遵循隨 機原則補齊每組動物為10

  • Morris水迷宮測試大鼠學習記憶能力

在各組大鼠28 d幹預完成後每天下午14:30 左右開始定位航行訓練連續5 d每天將大鼠麵向 池壁分別從4個平均分布的標記點輕輕放人水中記錄1 min內其找到水下平台所花費的時間逃 避潛伏期escape latency)。6天移除隱藏的平 台從定位航行實驗的第1個人水點將大鼠放人水 池記錄1 min內大鼠經過虛擬平台的總次數原平 台象限的活動時間與距離占總遊泳時間及總遊程 的百分比[11]

  • ELISATBA法分別測定前額皮質組織勻漿及血 清中SODMDA活性

水迷宮測試結束後大鼠用10%水合氯醛 (350 mg/kg)麻醉腹主動脈采血後斷頭取腦碎冰上 迅速分離出大鼠前額皮質預冷的生理鹽水洗淨血zi吸幹水分後稱質量製備成10%組織勻漿液分別低 溫離心機3 500 r/min離心勻漿液及血液15 min取 上清按照SODMDA試劑盒說明書操作測定

2.4電鏡觀察

大鼠麻醉處死後斷頭取腦碎冰上分離大鼠海 馬2.5%戊二醛固定2 h以上0.1 mmol/L磷酸 緩衝液清洗31%鋨酸固定1~2 h0.1 mmol/L 磷酸緩衝液漂洗3常規50%70%90%100% 丙酮脫水經過浸泡包埋固化後超薄切片機切片檸檬酸鉛和醋酸鈾雙染透射電鏡下放大20 000

觀察並拍照記錄

2.5統計方法

SPSS l7.0軟件進行統計分析實驗數據均 用x±s表示水迷宮逃避潛伏期采用重複測量方差 分析[12]其餘各組間比較使用單因素方差分析組間 兩兩比較使用LSD檢驗P<0.05表示差異有統計學 意義

3結果

3.1 水迷宮定位航行試驗

隨著訓練時間的延長各組大鼠逃避潛伏期逐 漸縮短與假手術組比較模型組第3天開始出現逃 避潛伏期延長P<0.01);與模型組比較中藥組西 藥組逃避潛伏期第3天開始縮短(P<0.01 )。與西藥組 相比中藥組逃避潛伏期稍有延長但差異無統計學 意義(P>0.05)。見圖11

3.2水迷宮空間探索試驗

與假手術組相比模型組大鼠原平台象限遊泳時 間百分比及遊泳距離百分降低差異有統計學意義 P<0.01);與模型組相比中藥組西藥組遊泳時間

及遊泳距離的百分比升高(P<0.05P<0.01);與西 藥組相比中藥組原平台象限遊泳時間所占百分比 稍有降低但兩者差異無統計學意義(P>0.05),中藥 組原平台象限遊泳距離所占百分比降低兩者差異 有統計學意義(P<0.01)。見表22

2補腎填髓湯對AD大鼠在原平台象限遊泳時間、

組別

遊泳時間百分比

遊泳距離百分比

正常組

59.06±10.39

29.22±6.46

假手術組

56.36± 11.40

27.99±4.22

模型組

28.61±9.86**

16.07±3.39**

西藥組

48.68±12.89##

23.53±4.34##

中藥組

44.27±9.95*##

21.97±5.13**#“

F

12.10

25.10

P

0.000

0.000

距離百分比的影響X±s,n=10,%)

 

與假手術組比較<0.05*<0.01;與模型組比較#<0.05, ##P<0.01;與西藥組比較▲▲P<0.01

2各組大鼠空間探索軌跡圖

3.3補腎填髓方對大鼠前額皮質組織及血清SODMDA酶活性的影響

與假手術組比較模型組SOD活性明顯下降MDA 活性顯著升高(P<0.01);與模型組比較中藥組西 藥組SOD活性均升高MDA活性均顯著下降(P<0.05P<0.01);西藥組與中藥組SOD活性MDA活性比 較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3

3.4補腎填髓方對大鼠海馬線粒體的影響

電鏡結果顯示正常組和假手術組線粒體形態 清楚完整大小形狀規則分布均勻且數目多外膜 平整光滑線粒體膜間隙無明顯擴張線粒體脊排列 整齊呈板層狀內膜和脊內腔含有較多均勻的顆粒 狀基質未見線粒體水腫及空泡化改變

模型組部分線粒體形態欠完整結構不清晰體 積縮小大小形狀不規則分布紊亂且數目減少線 粒體外膜模糊內脊大量斷裂或溶解消失線粒體腫 脹基質疏鬆清淡未見基質顆粒出現空泡化改變中藥組西藥組大鼠線粒體組織結構上較為完整清 晰大小形狀相對規則數目較模型組增多外膜可 見尚光滑內脊增多排列比較整齊偶可見脊內腔 稍有擴大內脊溶解減輕部分線粒體腫脹明顯改 善基質較均勻可見少許基質顆粒見圖3

3各組大鼠海馬線粒體電鏡觀察圖X20000)

4討論

 
  

AD是一種與年齡相關的神經係統退行性疾 病,P澱粉樣蛋白沉積成老年斑是AD病理標誌,並 且被認為直接損害學習能力和記憶[13],其中Ap^

 

夠自我組裝形成寡聚體和澱粉樣纖維而具有很強的 細胞毒性;A Pw作為它的反序列肽缺乏了自我組 裝及構成毒性寡聚態的能力不具有細胞毒性故而 在許多研究中作為APi-2的對照肽[14]條件恐懼放 射狀迷宮Morris水迷宮實驗Y迷宮實驗等均是 AD行為學評價的常用方法[15-16]AD患者後期多伴 有如幻想焦慮抑鬱等精神症狀曠場實驗是評價 實驗動物在新異環境中自主行為探究行為與緊張 度的一種方法常用於評價實驗動物在新異環境中的 焦慮狀態初期就選擇Y迷宮進行初篩並配合曠 場實驗評分既可避免Morris水迷宮初篩大鼠會遺 留對平台記憶幹擾後期Morris水迷宮測試結果又 可排除大鼠情緒原因引起自主活動差異而影響終 的測試結果造模後大鼠Morris水迷宮實驗測定結 果顯示模型組逃避潛伏期延長在原平台象限的遊 泳時間和遊泳距離百分比縮短假手術組未見明顯 變化表明模型大鼠學習記憶受損

AD發病機製複雜多種因素參與了它的發病過 程其中氧化應激可能在其中占有重要的地位大量 實驗研究及回顧性研究均提出AD發生發展與氧化 應激密切相關[17-19]盡管生理濃度的活性氧在體內 的一些信號通路中起著重要作用但活性氧的過度 產生會引起脂質蛋白核酸等分子損傷MDA是一 種重要的脂質過氧化產物表明了機體受氧化損傷的程 度活性氧的消除主要通過酶促及非酶促兩種途徑SOD是體內重要抗氧化酶可通過催化還原態單電 子氧轉化為過氧化氫從而清除體內氧自由基減輕 氧化損傷的程度維持生物體細胞成分正常的結構 和功能[20]通過抗氧化手段進行幹預或可延緩疾病 向AD終末的進展本實驗結果顯示模型組血清及 皮質抗氧化酶SOD活性均有下降MDA活性均表 現升高趨勢中藥組可以升高皮質及血清中的SOD 活性降低MDA活性表明補腎填髓方可以增強機 體的抗氧化能力拮抗過度產生的氧自由基這與薑 招峰等™的研究有共通之處其研究表明海馬及皮 層部位的氧自由基損傷與大鼠記憶及學習能力密切 相 關

由於線粒體電子傳遞中不可避免的出現電子泄 露成為了機體活性氧主要產生來源90%內源性氧自 由基均由線粒體而來線粒體自身亦可受到氧自由基的 破壞加劇線粒體的損傷從而形成惡性循環[22]本 研究通過電鏡觀察線粒體超微結構結果顯示模型 組線粒體形態不完整結構破壞體積變小分布紊 亂且數目減少出現空泡化改變表明AD模型鼠線 粒體整體結構受損大鼠灌服中藥補腎填髓方能使 線粒體組織結構部分恢複大小形狀變得規則數 目增多表明補腎填髓方對受損的AD大鼠線粒體 結構的破壞有改善作用

AD屬於中醫學癡呆”“呆證的範疇病性以 本虛標實為主以髓海空虛為本痰濁瘀血阻絡為 標而腎虛髓空是其根本原因腎與腦之間有著密不 可分的聯係,“癡呆的中醫藥治療多集中在補腎填 髓老年癡呆臨床辨證分型流行病調查也發現髓海 不足證在所有證型中出現頻次zui高[23]補腎填髓方 基於經典方劑孔聖枕中丹”(千金方》)化裁而成以yin羊藿何首烏為君藥功效在於滋陰補腎強精 益血臣藥龜板龍骨強精益髓增慧添智佐以遠 誌石菖蒲開竅豁痰醒神益智縱觀全方藥物組成主要功效在於補腎填髓且兼顧了化痰開竅現代藥 理研究表明yin羊藿中的成分yin羊藿苷可以通過抗 氧化應激、抗炎清除自由基抑製乙酰膽堿酯酶的 活性以及抑製AP聚集等途徑發揮對AD的改善作 [24]何首烏主要水溶性成分二苯乙烯苷可改善擬 癡呆大鼠的學習記憶能力提高大鼠海馬組織CA1 區腦啡肽酶及低密度脂蛋白相關受體1表達增強 對AP的降解和轉運[25]遠誌粗提物經D101大孔吸 附樹脂富集後發現皂苷類成分和黃酮類成分或許能 通過抗氧化應激改善小鼠的學習記憶功能m石菖蒲 的主要有效成分P-細辛醚可以改善認知功能其作用 機製包括了抑製炎症因子IL-ipTNF-a的分泌及下 調AQP4的表達來保護星形膠質細胞[27]

本實驗顯示補腎填髓方可以改善AD大鼠的學習 記憶能力增強抗氧化應激能力且能夠改善線粒體的 結構其機製可能與改善線粒體相關的氧化應激有 關更深人的機製研究還需下一步進行

 

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