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1,2-二氯乙烷亞急性暴露對大鼠抑鬱樣行為 及單胺神經遞質水平的影響
點擊次數:627 發布時間:2019-07-29

目的探討1,2-二氯乙烷1,2-DCE)亞急性暴露對大鼠抑鬱樣行為的影響及其可能單胺神經遞質的作用 機製方法無特定病原體級雄性SD大鼠隨機分為對照組和低高劑量組每組10分別予02040

80 mg/kg體質量1,2-DCE(以玉米油稀釋)灌胃染毒21連續染毒14染毒結束後采用曠場實驗

糖水偏愛實驗和強迫遊泳實驗觀察大鼠行為學變化情況,采用液相色譜-電化學檢測法測定大鼠大腦前額皮 層、海馬、紋狀體中單胺類神經遞質5-羥色胺(5-HT)去甲腎上腺素(NA)和多巴胺水平結果與對照組比較,

高劑量組大鼠直立次數中心區域活動時間和路程均減少P <0.05),糖水偏愛度下降P <0. 05),強迫遊泳實 驗中不動時間延長P<0. 05)大鼠前額皮層海馬紋狀體內5-HTNA和多巴胺水平均隨著1,2-DCE染毒劑量 的增加而下降P <0.05),呈劑量-效應關係高劑量組大鼠前額皮層海馬紋狀體內5-HTNA和多巴胺水平均 低於對照組P<0. 05)結論1,2-DCE亞急性暴露可誘導大鼠抑鬱樣行為,其機製可能與降低前額皮層海馬

紋狀體內單胺類神經遞質的水平相關

關鍵詞:1,2-二氯乙烷;抑鬱症;單胺類神經遞質;5-羥色胺;去甲腎上腺素;多巴胺;行為學;大鼠

 

  • 二氯乙院(1,2~dichloroethane, 1,2-DCE)是工 業上用途廣泛的有機溶劑,其屬高毒類神經性毒物; 在職業活動過程中短時間大量接觸1,24)CE可導致 職業性急性或亞急性1,2-)CE中毒,其主要靶器官是 中樞神經係統。行為功能改變是神經係統內在受 損的外部表現,神經損傷引起的行為學的改變可作為 反映神經毒性的評價指標。在中樞神經係統中,神經 遞質對突觸信息的傳遞起到興奮性或抑製性的作用, 主要包括單胺類遞質、氨基酸類遞質、膽堿類遞質和 神經肽等[4_5]。中樞神經係統內單胺神經遞質如5-羥 色胺(54iydroxytryptamine, 5-HT)、去甲腎上腺素 (norepinephrine, NA)和多巴胺的異常代謝可幹擾神經 突觸內信息傳遞,進而使睡眠、情緒調控和學習記憶 等神經活動受到影響。本研究通過觀察1,2-)CE 亞急性暴露對大鼠抑鬱樣行為的影響,並觀察大鼠大 腦前額皮層海馬紋狀體內5~HTNA和多巴胺水平 變化情況,為探討1,24)CE的中樞神經係統毒作用機 製提供參考。

1材料和方法

1.1動物無特定病原體級雄性SD大鼠廣東省實 驗動物中心,實驗動物生產許可證號:SCXK(粵)2013- 00002] 40隻,體質量180 ~220 g大鼠飼養於廣東省 職業病防治院實驗動物屏障設施(無特定病原體級動 物房)內實驗動物使用許可證號:SYXK (粵)2014- 0048],自由進食和飲水。本研究經廣東省職業病防 治院實驗動物倫理委員會批準。

1.2儀器和試劑曠場實驗裝置SuperMaze曠場試 驗視頻分析係統(XR-XZ301,上海芭乐app最新版下载黄信息科技有限公司);強迫 遊泳實驗裝置為帶有高度標記的透明圓柱形遊泳 ,上海芭乐app在线安装信息科技有限公司);0. 22 pm濾膜(上 海安譜實驗科技有限公司;Agilent RX~C18色譜柱 (250. 0 mm X 3.0 mm X5. 0 pm)Agilent 1260 液 相色譜係統(美國Agilent公司);CoulochemM電化學 檢測器(美國ESA公司Millipore超純水機(美國 Millipore 公司1,2~DCE (分析純純度彡99. 50%, 廣州化學試劑廠);玉米油(益海嘉裏食品營銷有限公 司);異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);高氯 酸(優級純NA、-辛烷磺酸鈉磷酸氫二鈉乙二胺 四乙酸二鈉三乙胺(均為色譜純度5~HT多巴胺(均 為分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);乙腈 (色譜純美國賽默飛世爾科技公司蛋白沉澱液為 含濃度為0.100 mmol/L的高氯酸和體積分數為 0. 01%乙二胺四乙酸二鈉的水溶液。磷酸二氫鈉緩衝 溶液為含濃度分別為1. 700、25. 000、0. 025、0. 700 mmol/L1-辛烷磺酸鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸 二鈉和三乙胺的水溶液,pH值為3. 0)

1.3動物分組與染毒大鼠經檢疫並適應性飼養 1周後,采用隨機數表法分為對照組和低、中、高劑量 組,每組10隻。本研究預實驗結果顯示,雄性SD大 鼠半數致死量為681 mg/kg體質量。參照本課題組前 期研究8 ,本研究設計1,2~DCE染毒劑量在低高 劑量組分別為20、40和80 mg/kg體質量。實驗時,低、 中高劑量組大鼠分別予質量濃度為204080 g/L1,2~DCE溶液(以玉米油配製)灌胃灌胃體積為 1 mL/kg體質量對照組大鼠給予等體積玉米油灌胃; 隔曰灌胃1次,共染毒14次。實驗期間觀察大鼠活 動、飲水飲食等情況。染毒結束時,3組大鼠共攝入相 當於0. 411、0.822、1.645倍半數致死量的1,2-DCE於末次染毒24 h後進行行為學測試。

1.4行為學測試

1.4.1曠場實驗實驗在4個塗黑敞箱內進行,敞箱 底麵等分成25個正方形。實驗在相對安靜的環境下 開始。將大鼠輕輕放入箱體中央,采集5 min內大鼠 在箱內的活動情況。中央和外周區域活動時間及路 程由Flyde-maze曠場試驗視頻分析係統記錄,直立次 數由未知實驗方案的研究人員記錄。

1.4.2糖水偏愛實驗實驗前進行大鼠糖水適應性 訓練:首先每籠放置2瓶糖水(質量分數為1.00%), 1 d後改為1瓶糖水和1瓶純水,連續放置24 h大鼠 經適應性訓練後,禁食禁水1 d,開始糖水偏愛實驗。 實驗開始前稱量1瓶糖水和1瓶純水的質量後將其放 入籠內由大鼠隨意飲用;24 h分別稱量糖水和純水的剩餘質量,計算消耗量,以分析大鼠的糖水偏愛度。 糖水偏愛度=糖水消耗量/總液體消耗量X100. 00%。 1.4.3強迫遊泳實驗適應性訓練:實驗前1 d,將 約23 °C的水注入強迫遊泳實驗裝置內,高度>30 cm; 將大鼠放入裝置,使其漂浮於水上,並使其下肢無法 觸及裝置底部以支撐其身體;當大鼠適應水溫和水環 境後,使其自由遊泳6 min24 h後,在相同的實驗條 件下,進行正式實驗觀察時間為6 min,觀察期內大 鼠在桶內自由遊泳。由未知實驗方案的研究人員記 錄大鼠2 ~6 min內的不動時間。以大鼠停止任何掙 紮,漂浮於水麵不動或僅做一些支持漂浮在水麵的輕 微肢體活動定義為不動狀態。

1.5腦組織樣品采集及處理於行為學測試結束 後,將大鼠放入麻醉裝置中給予異氟烷吸入,麻醉後 經腹主動脈采血,放血法處死。迅速取出全腦,於冰 上分離前額皮層、海馬和紋狀體等,置於凍存管,以液 氮迅速冷卻後,於-80 °C冰箱保存。檢測時,從冰箱 中取出凍存的組織樣品,稱質量後置於勻漿器中,按 1 g :5 mL比例加入預先冷凍4 C的蛋白沉澱液體,冰 浴下快速勻漿2 min勻漿液於4 C、4 000 xg離心 30 min,取上清液用0.22 pm濾膜過濾後,待測。

1.6腦組織中單胺類神經遞質水平檢測參照文獻 9],采用液相色譜-電化學檢測法測定1.5製 備的大鼠海馬、前額皮層和紋狀體樣品中5~HTNA和 多巴胺水平。色譜條件:流速1.0 mL/min;進樣體積 20 pL;流動相組成A相(磷酸二氫鈉緩衝溶液B(乙腈=90 : 10 (V/V);柱溫35 C ;檢測電勢: Et = -150 V,E2 =220 V。該方法的 5-HT、NA 和多巴 胺水平檢出限分別為1. 1、1. 0、1. 1 pg/L,加標回收 率分別為 88. 60% ~ 94. 60%、93. 50% ~ 95. 10%、 89. 90% ~95.50%。

1. 7統計學分析采用SPSS 23. 0軟件進行統計分 析。計量資料經正態性檢驗符合正態分布,以x ± s描 述;多組組間均數比較采用單因素方差分析,組間均 數兩兩比較方差齊時采用SNK檢驗,方差不齊時采用 Dennett T3法。采用兀線性回歸分析1,2—)CE染 毒劑量與單胺神經遞質水平的劑量-效應關係;檢驗

水準a =0.05 (雙側

2結果

2.1基本情況對照組和低劑量組大鼠毛發光澤、 精神狀態、活動、飲水和攝食均正常;中劑量組和高劑 量大鼠分別於染毒第9天和第5天後可觀察到活動和 精神狀態異常持續至染毒結束,表現為精神萎靡、俯 臥、活動減少、弓背。染毒周期內各組大鼠均無死亡。 2.2行為學實驗結果與對照組比較,中、高劑量組 大鼠直立次數、中心區域活動時間及路程均減少,糖 水偏愛度下降,遊泳中的不動時間延長,差異均有統 計學意義(P <0.05)。見表1。

2.3 1,2—)CE暴露對大鼠不同腦區中單胺類神經遞

質水平的影響4組大鼠前額皮層、海馬和紋狀體中 5~HTNA和多巴胺水平分別比較,差異均有統計學意 義(P <0.01)。兩兩比較結果見表2。可見,高劑量 組大鼠3種腦區組織中5~HTNA和多巴胺水平均低 於對照組,差異均有統計學意義(P <0.05)。分別以 前額皮層、海馬和紋狀體的3種單胺神經遞質水平 (y)1,2~DCE染毒劑量x)進行一元線性回歸分析, 結果顯示回歸方程均成立P< 0.01)。隨著

  • )CE染毒劑量的增加,前額皮層、海馬、紋狀體中 5~HTNA和多巴胺水平均下降,均呈劑量-效應關 係。 見表 3。

1 4組大鼠行為學指標比較結果 x±s)

組別

動物數

直立次數

中心區域活動

中心區域活動

總路程

糖水偏愛度

不動時間

(隻)

(次)

時間s)

路程mm)

(mm)

(%)

C s)

對照組

10

25.5±5.7

21.8±6.5

175.5±24.0

1 838.9 ±299.4

71. 00 ± 8. 60

50.1 ?1.8

低劑量組

10

24.6±4.0

20.0 ±4.5

180.3 ?7.5

1 897.2 ?68.3

68.50 ?.80

55.8 ?0.4

中劑量組

10

19.5?.1ab

15.0?.8ab

147.7?4.2ab

1 703.7 ?09.8

59.50?0.50a

64.0?.8a

高劑量組

10

17.4?.0ab

13.9?.7ab

140.7?6.4ab

1 616.2 ?46.4

59.30?1.30a

61.6?.9a

F

 

6.81

7.16

4.95

2. 04

4. 26

4. 36

P

 

<0.01

<0.01

<0.01

0. 12

0. 01

0. 01

注:與對照組比較,P <0.05;與低劑量組比較,bP <0. 05

 

 

2 4組大鼠前額皮層海馬紋狀體中5~HTNA和多巴胺水平比較X禦,ng/g)

組別

動物數

 

5-HT

 

 

NA

 

 

多巴胺

 

(隻)

前額皮層

海馬

紋狀體

前額皮層

海馬

紋狀體

前額皮層

海馬

紋狀體

對照組

10

281.3±29.0

176.1 ?3.1

499.8?2.6

190.6±52.6

328.6 ?2.0

166.9?3.9

270.1 ?3.6

138.3?7.7

4738.2?25.5

低劑量組

10

266.2 ±32.8

159.1 ?6.9

471.2?3.4

179.3 ?2.2

323.0?1.4

161.9?6.5

256.3 ?0.8

121.9?9.2

4516.2?11.0

中劑量組

10

251.0±47.6

138.5?8.4a

335.9?5.6ab

122.6?4.8ab

253.0 ?7.4ab

109.7?0.5ab

249.6?2.1

112.1?1.5a

3 957.4?95.4a

高劑量組

10

194.1?1.9abc

102.4?6.5abc

328.4?9.4ab

119.8?3.7ab

239.8 ?3.0ab

97.4?7.9ab

172.2?1.2abc

74.9?0.0abc

3 182.4?505.7abc

F

 

9.78

14.57

19.98

6.37

4. 86

5. 48

10.16

18.71

10.86

P

 

<0.01

<0.01

<0.01

<0. 01

<0. 01

<0.01

<0.01

<0.01

<0.01

注:與對照組比較,aP<0.05;與低劑量組比較,bP<0.05;與中劑量組比較,cP<0.05

 

 

3 1,24)CE染毒與前額皮層、海馬、紋狀體5~HTNA和多巴胺水平的劑量-效應關係分析結果

單胺神經遞質

 

回歸方程

決定係數

F

a

t

P2

5-HT

前額皮層

y =

-1.10 x

+286.67

0. 44

29.44

<0.01

30. 87

<0.01

海馬

y =

-0.93 x

:+ 176.55

0. 55

46.06

<0.01

28.14

<0.01

紋狀體

y =

-2.32 x

:+489.88

0. 49

36. 42

<0.01

27.86

<0.01

NA

前額皮層

y =

-0.96 x

+186.65

0. 27

14. 08

<0.01

15.94

<0.01

海馬

y =

-1.23 x

+ 329. 02

0. 24

11.79

<0.01

20.10

<0.01

紋狀體

y =

-0.95 x

+ 167. 38

0. 26

13. 58

<0.01

14.11

<0.01

多巴胺

前額皮層

y =

-1.23 x

+ 280. 08

0. 42

27.08

<0.01

25.88

<0.01

海馬

y =

-0.78 x

+139.18

0. 60

57. 60

<0.01

29.47

<0.01

紋狀體

y =

-20.17

x +4 804.44

0. 47

33.53

<0.01

30. 10

<0.01

:FPi值和tP2值分別為回歸方程檢驗和回歸係數檢驗的結果

3討論

機體受到環境中病毒、細菌和有毒有害化學物質 等因素影響後,在出現病理改變和臨床症狀前通常會 出現行為功能障礙或其他指標異常;特定行為學的改 變能夠準確反映中樞神經係統的生理或病理狀態,可 作為神經毒性的前期指標M1,24)CE急性或亞急 性中毒主要臨床表現為中毒性腦病,腦水腫為主要病 理基礎tt1-121,24)CE中毒患者可出現頭暈、情感淡 漠、譫妄、抽搐、記憶力下降、反應遲鈍、計算力下降等 臨床症狀M ;患者病情遷延,易反複或突然惡化,後遺 症發生率及死亡率高對生命和健康影響極大。因 此,研究1,24)CE對神經行為的影響對闡明其神經毒 性具有重要意義。

本課題組前期的Morris水迷宮實驗結果顯示,以 劑量為100和350 mg/m31,24)CE靜式吸入連續染 毒28 d,可引起小鼠空間學習和記憶能力下降,且隨 著染毒劑量增加和時間延長,其毒性效應增強M。楊 光謙等15的研究以劑量為1 200 mg/m31,2-)CE 靜式吸入染毒3 d,結果導致小鼠出現腦損傷,行為學 表現為抱爪現象。曠場實驗主要用於評價實驗動物 在新異環境(即開闊環境中的自主行為、探究行為與 緊張度16。糖水偏愛實驗可反映大鼠欣快感E7]。強 迫遊泳實驗也被稱為絕望實驗,是經典的抑鬱類行為 學實驗,主要測量動物的活躍性;其中的漂浮行為被 用作分析“絕望”的參數,因此也被認為是類似抑鬱的 行為M。本課題組前期以劑量為79 mg/kg體質量的

  • )CE隔日灌胃染毒大鼠4周(與本研究的1,24)CE 染毒劑量與染毒時間相近),結果顯示,大鼠出現易激 惹、弓背、活動減少、精神萎靡等活動異常°8 ;與本研 究觀察到的中、高劑量組大鼠行為學改變_致。但該 研究觀察到,大鼠的大腦、小腦皮質與白質組織病理學 檢查均未見明顯結構性異常,亦未見出血、水腫與壞 死8 ;提示在該研究設計的1,24)CE染毒條件下,尚未 導致大鼠腦組織出現明顯的腦水腫病理改變。在此基 礎上,本研究結果顯示,與對照組比較,中、高劑量組大 鼠直立次數、中心區域活動時間和路程均減少(P < 0. 05),糖水偏愛度下降(P <0. 05),強迫遊泳實驗中不 動時間延長P<0.05);提示1,2-)CE亞急性染毒可 導致大鼠的自發活動能力和探索能力降低,快感缺 失,求生yu望下降,出現類似抑鬱症狀。

職業性有機溶劑接觸可對職業工人的心理健康 狀況產生不同程度的損害。有研究結果顯示,苯係物 職業接觸可引起女性工人在人際關係敏感、抑鬱、焦 慮、敵對4個因子評分上明顯上升E9];正已烷接觸工 人消極情緒(緊張-焦慮、抑鬱-沮喪、憤怒-敵意、 疲憊-惰性、困惑-迷茫)得分升高,而心算平均準確 數、心算能力平均指數、聽數字廣度平均準確數、聽數 字廣度能力指數、曲線吻合平均準確數、曲線吻合平 均能力指數、目標追蹤平均準確數均下降M ; 1,24)CE中毒性腦病患者的焦慮和抑鬱評分值明顯升 高M ;但機製尚不清楚。抑鬱症病因複雜,且受多種 環境、生理和心理性因素影響°22。目前抑鬱症病因機 製主要研究包括:炎症假說、氧化應激假說、神經營養 假說和神經遞質假說等^-25 ;其中以單胺神經遞質 假說為久遠成熟,該機製認為腦內單胺類神經遞質 如5~HTNA多巴胺等的缺乏或代謝異常是導致抑鬱 症的主要因素^6-28。抑鬱症患者腦的結構和功能 改變主要存在於前額皮層、海馬和紋狀體等29];而精 神活動的異常與中樞神經係統突觸內的單胺類遞質 5~HTNA和多巴胺代謝水平失衡密切相關°9。本研 究發現,隨著1,2~DCE染毒劑量增加,大鼠紋狀體、海 馬和前額皮層中5~HTNA和多巴胺均呈下降趨勢 (P<0.05);其中,高劑量組大鼠3個腦區中5~HT、NA 和多巴胺水平均低於對照組(P < 0. 05);提示

  • )CE誘導大鼠抑鬱樣行為可能與單胺類神經遞質 水平的下降密切相關。

綜上所述,1,2—)CE亞急性暴露可誘導大鼠出現 抑鬱樣行為,其機製可能與降低前額皮層、海馬和紋 狀體內單胺類神經遞質的水平變化有關。但該機製 研究隻是對神經遞質改變的初步探討,具體哪些相關 信號通路(蛋白和RNA)參與了該過程尚需進一步深 入研究。

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