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巴恩斯迷宮實驗對缺血性腦卒中大鼠行為學的影響
點擊次數:557 發布時間:2019-07-19

腦血管疾病是威脅人類健康的重大疾病之一,包 括缺血性和出血性兩類[1]。缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular diseaseICVD)在老年人中具有高發 病率、患病率、致殘率和死亡率,且發病逐漸年輕化。 加大腦血管病防治力度,改善預後,預防並發症,提高 腦血管疾病的療效是一項刻不容緩的重任。目前,雖 然對ICVD的治療取得了較大的進步,在溶栓和(或) 取栓同時,也可使用神經保護劑來避免或減少再灌 注損傷,但仍無一種神經保護的藥物可使患者從中 獲益[2],研究表明電針在ICVD中的應用中能促進其 功能恢複[3],己是缺血性腦血管病的常規治法。本實 驗主要通過電針來幹預腦缺血大鼠模型,為針刺治療 ICVD提供實驗研究依據。

1材料

1.1實驗動物選擇18月齡,雄性,體質量200〜

250 gSD大鼠80隻,均購買並飼養於安徽中醫 藥大學實驗動物中心,預適應1周後方開始實驗。 大鼠選用清潔級顆粒飼料喂養,並予自由飲食及飲 水,視墊料清潔的程度更換墊料。飼料和墊料均購文草編號:1000-2723(2018) 04-0025-04 買於安徽中醫藥大學實驗動物中心,飼養環境模擬 標準日夜係統。

1.2實驗儀器G6805型電針治療儀:蘇州醫療用 品廠有限公司;電凝器;牙科鑽;華佗牌一次性針灸 針蘇州規格為直徑0.2 mm針身長0.5Barnes 迷宮測試板、圓形滾筒:上海芭乐app在线观看XR-XB108型巴恩 斯迷宮視頻分析係統。

2實驗方法

2.1實驗分組80隻SD大鼠隨機分為假手術組

(該組隻行血管分離)、模型組、電針對照組、電針組, 每組20隻。

2.2大腦中動脈閉塞大鼠模型的建立及成功與否檢

測的方法在室溫25 °C條件下,SD大鼠稱重後,根 據羅燕等[4]提出的熱凝閉大腦中動脈法製造局灶性 腦缺血大鼠模型:將SD大鼠右側臥位固定於手術台 上,去除左側顳頂部的鼠毛,碘伏對顳頂部局部皮膚 消毒。左眼與左耳之間切開皮膚,鈍性分離顳肌,暴露 出顳骨翼板,術中避免損傷周圍血管及神經等。用牙 科鑽經顳骨翼板鑽至硬腦膜,用小咬骨鉗向下咬去部分顱骨,暴露大腦中動脈,用電凝器來凝閉大腦中動 脈(嗅束到大腦下靜脈),後縫合顳肌及皮膚。

假手術組:同上操作到暴露大腦中動脈,不進行 熱凝閉。

大鼠蘇醒後參照Zea Longa E[5]提出的神經行 為學評估法進行評分,評分1~3分表示造模成功,采 用差額補充的方法保證每組實驗的例數。

2.3處理方法電針組:造模成功後將不予麻醉的 大鼠固定在自製鼠夾上。根據華興邦等[6]製定的大 鼠針灸穴位進行定位,選用“醒腦開竅”針刺法[7],主 穴取水溝、百會和雙側內關、三陰交。先用撚轉、提插 瀉法刺激雙側內關1 mm至筋間,刺激1 min留針 30 min;次用雀啄法由鼻中隔下部向上斜刺水溝1 mm強刺激1 min;再應用提插法直刺三陰交5 mm持續1 min;後刺百會穴,取向前或向後斜刺2 mm采用平補平瀉撚轉手法刺激1 min留針30 min留針期間,分別用G6805電針治療儀連接內關 和三陰交穴位的針柄,施以疏密波,調整電壓為2~4 V頻率為2/100 Hz以針刺部位輕微抖動為刺激強 度。第1次針刺在造模成功後的24 h內進行,以後每 天上午固定時間針刺1次每7 d為1個療程(連續 針刺6 d休息1 d)[8-9]

電針對照組:SD大鼠不進行任何手術,抓取、固 定方法針刺穴位方法頻率電針刺激參數等同電 針治療組。

假手術組、模型組:抓取、固定方法參數等同電針 組,但不進行針刺。

2.4觀察指標

2.4.1大鼠神經行為學評分[5] 0分:無神經缺損症

狀;1分:將大鼠提尾倒懸時,左側前爪不能完全伸 展;2分:爬行時左側轉圈;3分:行走困難、向左側傾 倒;4分:不能自發行走,意識喪失。

2.4.2 Barnes記憶分析係統檢測訓練過程:將大鼠 逐隻放在圓形漆黑Barnes迷宮測試板上,測試板的 周圍有20個洞口,底部放置底盒的一個洞口稱之為 隱藏區,其餘稱之為暴露區,每次訓練開始時將大鼠 放置於隱藏區讓其適應30 s然後將其放在迷宮中 央自由選擇進入隱藏區每次訓練240 s每隻老鼠 做完以後都用酒精對迷宮進行擦拭。每天下午每隻大 鼠連續訓練2次連續訓練6 d

測試過程:第1 d訓練結束後按分組測試,然後 連續訓練6 d後第7 d開始測試,按分組開始測試, 測試過程同訓練過程,每隻測試2次Barnes迷宮

映了動物的空間記憶功能。

2.4.3滾筒掉落時間檢測選用直徑20 cm圓形滾 筒設定轉速為5轉/min測試時間為5 min按照分 組將大鼠放在滾筒中傾斜60。每次可測試3隻大 鼠每隻測試3次記錄大鼠掉落平台時間長測試 時間為 5 min

2.5統計學方法所有計量資料均用均數±標準 X± s)表示Barnes記憶持續時間、大鼠進入隱藏 區的次數、進入的潛伏期以及滾筒掉落時間等參數 的比較采用單因素方差分析。統計結果,均由SPSS for windows 19.0自動運算完成P<0.01為有顯著統 計學意義P<0.05為有統計學意義P>0.05為無統 計學意義。

3結果

3.1神經行為功能評分假手術組、電針對照組未 見神經行為功能缺損症狀,電針後神經行為功能評 分較模型組降低,其中電針24 h降低無統計學意義 CP=0.23)電針7 d和14 d降低均有顯著統計學意 義P7d = 0.002d < 0.001)說明電針可改善缺血性 腦卒中大鼠的神經行為功能評分。見表1。

表1各組大鼠神經行為功能評分比較(X±sn=10,分)

分組

24 h

7 d

14 d

模型組

2.97±0.41

2.82±0.34

2.78±0.31

假手術組

0.00±0.00

0.00±0.00

0.00±0.00

電針對照組

0.00±0.00

0.00±0.00

0.00±0.00

電針組

2.78±0.28

2.38±0.41**

1.73±0.43**

注:與模型組比較,**P<0.01

3.2進入隱藏區的潛伏期分析結果假手術組、電

針對照組大鼠進入隱藏區的潛伏期均較短,兩者比 較差異無統計學意義CP24 h = 0.94、7 d = 0.90、PM d = 0.90),說明電針刺激對大鼠進入隱藏區的潛伏期無 直接影響。電針後大鼠進入隱藏區的潛伏期較模型組 縮短,其中電針24 h縮短有統計學意義CP24h<0.05)電針7d14d縮短有顯著統計學意義P7〆 0.001,PMd<0.001),說明電針可改善缺血性腦卒中大 鼠進入隱藏區的潛伏期。見表2。

表2各組大鼠進入隱藏區的潛伏期比較(x±sn=10,分) 分組 24 h 7 d 14 d

238.57±2.74

3.27±0.97

3.19±1.33

233.10±4.11*

注:與模型組比較*P<0.05;與模型組比較**P<0.01

 

3.3 Barnes記憶持續時間假手術組、電針對照組 大鼠Barnes記憶持續時間差異無統計學意義CPz4h = 0.89、P7d = 0.74、PMd = 0.86),說明電針刺激對大鼠 Barnes記憶持續時間無直接影響;電針後Barnes記 憶持續時間較模型組延長,電針24 h、7 d和14 d延 長均有顯著統計學意義(P4 h < 0.001P/ d < 0.001d <0.001),說明電針可改善缺血性腦卒中大鼠的空間 記憶能力。見表3。

3各組大鼠Barnes記憶持續時間比較(x眘10, s)

分組

24 h

7 ds

14 d

模型組

0.00±0.00

0.00±0.00

0.00?.00

假手術組

14.79±2.75

16.35±3.01

18.66±3.77

電針對照組

14.92±3.23

16.71±2.93

18.41?.66

電針組

0.00±0.00

7.13±2.42**

12.61±3.93**

注:與模型組比較,**P<0.01

3.4滾筒掉落時間分析結果假手術組、電針對照

組大鼠滾筒掉落時間差異無統計學意義CP24h = 0.41、 P7d = 0.68、PMd = 0.74),說明電針刺激對大鼠滾筒掉 落時間無直接影響;電針後滾筒掉落時間較模型組延 長,其中電針24 h延長無統計學意義P = 0.53),電 針7 d和14 d延長均有顯著統計學意義P/d< 0.001, PMd<0.00)說明電針可延長大鼠從滾筒上掉落的 時間。見表4。

4各組大鼠滾筒掉落時間比較(x眘,n=10 , s)

分組 24 h 7 d 14 d

模型組 38.78?1.16 55.60?3.59 79.25?4.10

假手術組 289.16?.17 289.49?.69 290.87?.72

電針對照組 284.77?3.78 286.0?2.89 289.17?0.32

電針組 42.13?1.27 109.54?1.99** 178.93?1.68**

注:與模型組比較**P<0.01 4討論

缺血性腦血管病ICVD)屬於中醫學“中風”範 疇,其病機多是陰陽失調,血氣運行受阻,血瘀滯絡, 蒙蔽清竅而成[10]。針刺治療,包括頭皮針、電針等因具 有經濟、簡便、療效確切等特點而廣泛用於腦血管病 的治療[11]

采用石學敏院士“醒腦開竅”針刺法來刺激該實 驗大鼠,此法中的水溝、百會穴有醒腦、開竅、定誌的 功效。大鼠水溝穴的定位取唇裂鼻尖下1 mm正中 處,直或向上刺1 mm;百會為“諸陽之會”,取頂骨正 中,向前、後斜刺2 mm[6]關於電針水溝穴治療腦血 管病的機製研究頗多,李莎莎等[12]發現電針刺激水溝 穴可能通過調控微小RNA-126及其靶基因、促進腦 血管新生,從而提高反應神經功能損傷程度的 Berderson評分,促進大鼠腦缺血後的神經功能恢複。 Wang[13]研究發現電針水溝穴通過大電導Ca2+-K+通道(BKCa通道)的過度激活和表達可能是腦 缺血/再灌注損傷後神經元延遲死亡,從而改善缺血 再灌注大鼠神經功能。該實驗選用水溝穴既有“醒腦 開竅”作用,又有現代機製方麵研究的支撐。該實驗發 現通過“醒腦開竅”刺法,可改善缺血性卒中大鼠的神 經功能評分,與李莎莎、Wang等的研究結果類似。

認知和記憶功能的研究屬於神經心理學研究範 疇,神經心理學是當今“腦科學時代”的一門新興學 科,它把腦當作心理活動物質載體從而研究腦與行為 的關係[1]。臨床檢測記憶或認知功能有韋氏記憶量 表MMSE簡易智能精神狀態量表以及MoCA量表 [14],研究[15-16]發現電針刺激可改善腦卒中後患者的 記憶和認知功能。然而,對於動物實驗的研究,相關量 表完成困難,1976年Barnes發明了 Barnes迷宮,主 要用於測量動物的空間記憶功能,這與Morris水迷 宮相比對動物的刺激更少[17]。近年,隨著信號通路的 不斷被挖掘,研究動物認知和記憶功能則多基於認知 和記憶相關傳導通路[18]、機製方麵,Huang[19]發現電 針百會、神庭穴可下調大腦中動脈閉塞-再灌注大鼠 的促炎因子白細胞介素-1P表達水平,抑製星形膠質 細胞和小膠質細胞/巨噬細胞P2嘌呤受體介導的神 經炎性損傷Lin[20]通過電針百會、神庭穴可抑製腦 缺血再灌注大鼠模型的基質金屬蛋白酶-2和基質金 屬蛋白酶-9的表達,減輕腦超微結構損傷,從而提高 其記憶能力。Yu[21側從另一角度研究記憶能力,發 現電針百會、大椎穴可提高事件相關電位P300,改善 腦梗死大鼠學習記憶能力。誘發電位中的事件相關電 位主要反映認知過程中大腦電生理的變化,其中 P300電位應用廣泛。該實驗通過觀察大鼠Barnes 記憶持續時間、滾筒掉落時間等指標發現電針可改善 腦梗死模型大鼠的記憶功能。

該實驗研究結果提示,Barnes迷宮實驗表明電 針對照組、假手術組大鼠進入隱藏區的潛伏期縮 短、記憶持續時間延長優於電針組,電針組優於模 型組;滾筒掉落時間測試也表明電針對照組、假手 術組掉落時間延長優於電針組,電針組優於模型 組,反應“醒腦開竅”針刺法能使大腦中動脈閉塞模 型大鼠記憶

及運動能力改善,且在一定範圍內,隨 著電針時間的延長,記憶及運動功能改善越明顯。 Barnes記憶分析係統及滾筒掉落時間可客觀地反映 大鼠記憶及運動功能的變化。

雖然大鼠行為學研究的指標不能完全等同於人 類,但由於倫理學的限製,先在動物模型上做實驗是 研究的必要途徑。周鵬[22]等發現電針治療腦缺血再灌 注損傷是通過多途徑,作用於多靶點來實現的。該實 驗目前僅觀察了神經功能評分、Barnes記憶持續時 間、滾筒掉落時間等指標,記憶相關信號通路的各個 靶點,甚至大鼠事件相關電位P300等的是筆者下一 步研究的方向。

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